还原型谷胱甘肽对胰腺炎相关性腹腔积液诱导的大鼠肝损伤的疗效及其机制

　　【摘要】 目的 建立大鼠经腹腔内注射胰腺炎相关性腹腔积液(PAAF)诱导的急性肝损伤模型并研究还原型谷胱甘肽(GSH)对该损伤的疗效及机制。方法 先制备急性出血坏死性胰腺炎模型(AHNP)并收集PAAF。A组(对照组)腹腔内注射生理盐水，B组(模型组)腹腔内注射PAAF，C组(GSH治疗组)在向腹腔内注射PAAF前1 h于尾静脉注射GSH。腹腔注射后6 h、12 h分批处死大鼠，每时间点8只。测定大鼠ALT、AST、血清淀粉酶(AmYL)浓度，TBA法检测肝组织丙二醛(MDA)含量，ELISA法检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-6)，苏木精-伊红染色后光镜观察胰腺及肝损伤情况。结果 B组血清ALT、AST、AmYL较同时间段A组升高(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6浓度及肝组织MDA含量明显升高(P<0.05)，B组肝细胞水肿、炎性细胞浸润;C组与同时间段B组相比上述各指标均有降低(P<0.05)，肝病理损害较轻。结论 GSH通过抗氧自由基、炎症递质的作用减轻PAAF诱导的肝损伤。

　　【关键词】 胰腺炎相关性腹腔积液;还原型谷胱甘肽;肝损伤

　　Effect and mechanism of reduced glutathione on liver injury induced

　　by pancreatitis-associated ascitic fluid in rats

　　JIANG Baofei1, LIU Bin2*, ZHANG Jianhuai1, YU Ren1, GE Hengfa1

　　(1. Department of General Surgery, The Affiliated Huai′an Hospital of Nanjing Medical University,

　　Huai′an, Jiangsu 223000, China; 2. Department of General Surgery, The Affiliated Hospital

　　of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract:Objective To investigate the therapeutic effect of reduced glutathione (GSH) on acute liver injury induced by peritoneal injection of PAAF by establishing the animal injury model in rats and to explore the possible mechanisms underlying the injury and protection. Methods 40 rats were prepared to establish AHNP models. Another 48 rats were randomized into 3 groups (n=16): group A served as the normal control, with 8 ml normal saline (NS) injected into the peritoneal cavity of the rats; group B as the model control with 8 ml PAAF injected intraperitoneally; group C as the treatment group, with GSH at the dose of 400 mg/kg administrated into the caudal vein 1 h before PAAF injection. At 6 h and 12 h after intraperitoneal injection, the rats were sacrificed in two batches, with 8 rats per batch. The concentration of ALT, AST, AMYL and MDA were measured. Histopathological examination of the liver and pancreas samples were examined with hematoxylin and eosin stain. The levels of IL-6 and TNF-α in serum were detected by ELISA.Results The levels of ALT, AST, TNF-α were higher than those in group A at during the same period (P<0.05), while IL-6 in the serum and MDA in liver tissue in group B were significantly higher than those in group A (P<0.05). There was edema in liver cells in group B, with infusion of inflammatory cells. The parameters mentioned above were simultaneously lower in group B compared with those in group C, suggesting the pathological injury was reduced after GSH administration.Conclusions The animal models of acute liver injury induced by PAAF were successfully established and GSH can reduce the PAAF-induced acute liver injury by resisting the effects of oxygen free radicals and inflammatory mediators.

　　Key words： pancreatitis-associated ascitic fluid; reduced glutathione; liver injury

　　急性坏死性胰腺炎(acute hemorrhage necrosis pancreatitis,AHNP)时可产生大量胰腺炎相关性腹腔积液(pancreatitis associated ascitic fluid,PAAF)，其含有多种毒性物质和有害物质，由于肝是胰腺血液回流的第一站，同时又是多种细胞因子的灭活场所[1]，肝是重症急性胰腺炎(SAP)时主要受损脏器之一。目前研究主要集中于胰腺病变所引起的肝损害，而对胰腺炎相关性腹腔积液(PAAF)是否可导致肝损害研究甚少。为此，本实验用谷胱甘肽(GSH)治疗PAAF诱导的肝损害大鼠，通过观察肝功能指标及血清TNF-α、IL-6以及肝组织丙二醛(MDA)含量，从而探讨其可能的机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物和试剂 清洁级健康成年SD大鼠，雌雄不拘，体重250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司,注射用GSH由重庆药友制药有限责任公司提供。ALT、AST、血清淀粉酶(AmYL)浓度应用全自动生化分析仪测定， TNF-α、IL-6、MDA试剂盒购自上海领潮生物科技有限公司。

　　1.2 大鼠急性胰腺炎相关性腹腔积液的制备 参照文献[2-3]诱导建立大鼠AHNP：大鼠术前12 h禁食，自由饮水;10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，正中切口入腹，以无损伤小动脉夹暂时阻断肝门侧胆总管，以套管针针头由十二指肠前壁进针，经乳头部插入胆总管内，以5%硫磺胆酸钠1 ml/kg匀速注入，拔针后局部指压穿刺部位防止逆流。5 min后开放胆总管阻断，胰腺在短时间内可见出血水肿，局部坏死，大鼠AHNP诱导成功。30 min后取腹腔渗出液测定淀粉酶，浓度在2～10万U/L者纳入本实验。

　　1.3 PAAF的收集处理及大鼠肝损伤诱导模型的建立 ANP大鼠模型建立后7 h，无菌状态下收集PAAF，4℃、2500 r/min离心15 min，取上清液。每只AHNP大鼠产生5～10 ml PAAF，38只共收集约300 ml，于-80℃保存备用。另48只SD大鼠随机分为3组，每组16只：A组(对照组)腹腔内注射生理盐水8 ml/只，B组(模型组)腹腔内注射PAAF 8 ml/只，C组(GSH治疗组) 在向腹腔内注射PAAF前1 h于尾静脉注射还原型谷胱甘肽400 mg/kg，相应地A、B两组尾静脉注射以等容积的生理盐水替代。各组动物自由进食饮水，腹腔注射后6 h、12 h分批处死大鼠，每时间点8只。

　　1.4 检测指标 检测血清中ALT、AST、AmYL;TNF-α，采用双抗体夹心法;TBA比色法检测肝脏组织MDA含量;胰腺、肝脏组织病理学检查(苏木精-伊红染色，光镜观察)。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包处理，采用t检验或者方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组不同时点ALT、AST及AmYL水平 B组血清ALT、AST、AmYL较同时间段A组升高(P<0.05);C组与同时间段B组相比上述各指标均有降低(P<0.05)。见表1。表1 各组不同时点ALT、AST及AmYL水平与A组比较：△P<0.05;与B组比较：*P<0.05;与6 h点比较：▲P<0.05

　　2.2 胰腺及肝的病理组织学改变 PAAF腹腔注射6 h、12 h后，可以看到胰腺腺泡结构及胰岛结构完整，仅有胰腺叶间隔增宽，轻度水肿，少量炎性细胞浸润,未见胰腺实质出血、腺泡坏死等表现(图1、2)。肝细胞组织明显充血水肿，部分气球样变并见大量炎细胞浸润,细胞界限较模糊(图3)。C组6 h点肝细胞组织水肿及炎细胞浸润程度均较B组6 h点有所减轻(图4)。

　　2.3 血清TNF-α和IL-6的测定结果 B组大鼠血清TNF-α、IL-6浓度在诱导后6 h和12 h均较A组升高，差异有统计学意义(P<0.05);而C组大鼠血清TNF-α、IL-6浓度较B组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

　　2.4 肝组织中MDA的含量测定 与A组相比，B、C组相应时点MDA值增高，差异有统计学意义(P

　　3 讨 论

　　薛育政[4]等研究表明，还原型谷胱甘肽腹腔注射后能够改善急性坏死性胰腺炎大鼠的胰腺组织损害，为解决SAP时应用还原型谷胱甘肽后，肝损伤的改善是还原型谷胱甘肽对肝直接作用还是胰腺病变转归后的继发改善的争议，我们将PAAF注入健康大鼠腹腔作为模型组，腹腔内注射PAAF并予以还原型谷胱甘肽干预作为处理组。经过胰腺病理学检查，该模型具有“屏蔽”坏死胰腺的作用，可以在避免胰腺病变影响的较为单纯的背景下研究还原型谷胱甘肽对肝的保护作用机制。

　　在本实验中，B组6 h点即可测到大鼠血清炎症介质TNF-α、IL-6水平较A组明显增加，可以初步推测炎症介质如TNF-α、IL-6参与了肝损伤过程。在C组应用GSH治疗后TNF-α、IL-6水平较B组下降，大鼠的各项肝功能指标下降，肝病理损害亦相应减轻，也证实了这种推测。这与国内外相关报道相一致，在急性胰腺炎早期应用抗TNF单克隆抗体[5]、IL-1受体拮抗剂、血小板活化因子PAF拮抗剂、IL-6单克隆抗体后实验动物急性胰腺炎的炎症参数均比对照组有了明显改善，全身及局部症状明显改善，病死率也大大下降。

　　氧自由基在重症急性胰腺炎并发肝损害过程中具有重要作用，机体通过酶系统和非酶系统产生自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤，因此形成脂质过氧化物丙二醛(MDA)的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞受损的程度。本研究结果显示C组肝组织MDA含量较同时段B组降低，表明GSH能清除氧自由基，降低MDA含量，对肝脏因脂质过氧化造成的损伤具有保护作用，同时还能改善与PAAF诱导的肝功能损害相关的生化和病理指标。

　　【参考文献】

　　[1] Davies MG，Hagen PO. Systemic inflammatory response syndrome [J]. Br J Surg,1997,84(7):920-935.

　　[2] Lankisch PG, Ihse I. Bile-induced acute experimental pancreatitis [J]. Scand J Gastroenterol, 1987,22(3):257-260.

　　[3] 罗军,叶德存.急性胰腺炎大鼠肝肾、超微结构的改变及其与氧自由基的关系[J].中华实验外科杂志,1995,12(3):133-134.

　　[4] 薛育政,刘宗良，俞宪民，等.还原型谷胱甘肽对实验性急性坏死性胰腺炎的治疗效果及机制[J].胰腺病学,2007,7(4)：212-215.

　　[5] 苏倩波.抗肿瘤坏死因子单克隆抗体临床应用新进展[J].医学综述，2006，12(5)：293-295.