Wnt3基因在急性髓系白血病中的表达及意义

　　【摘要】 目的 研究Wnt3基因在急性髓系白血病(AML)患者中的表达及其意义。方法 应用实时定量PCR(real-time PCR)方法检测10名正常人、40例AML患者中Wnt3基因的表达。结果 10例正常人中检测到较低水平Wnt3基因的表达;Wnt3基因在AML患者中的表达水平增高，AML缓解后Wnt3基因的表达水平较初诊时明显降低;Wnt3的表达与AML患者年龄、性别以及初诊白细胞数等临床特征无关;Wnt3低表达组完全缓解率高于高表达组。结论 Wnt3在AML发病中可能起重要作用，可作为判断AML预后的一个指标。

　　【关键词】 急性髓系白血病;Wnt3基因;基因表达

　　Expression and significance of Wnt3 gene in acute myelogenous leukemia

　　LI Shengli, XU Kailin, LI Zhenyu*, PAN Xiuying, ZENG Lingyu

　　(Department of Hematology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract： Objective To explore the expression and significance of Wnt3 gene in acute myelogenous leukemia (AML) patients. Methods Expression of Wnt3 gene was detected by real-time PCR in 10 healthy people and 30 AML patients. Results The expression of Wnt3 gene was lower in the 10 healthy people and was higher in AML patients. There was marked decline in the expression level of Wnt3 gene after complete remission as compared to the initial treatment. The expression level of Wnt3 gene was not correlated with the age, gender and the clinical characteristics at initial diagnosis such as the white blood cell (WBC) count and chromosomal karyotype in AML patients. The complete remission (CR) rate in AML patients with low expression level of Wnt3 gene was higher than that in those with high expression level. Conclusion Wnt3 may play an important role in AML pathogenesis and can serve as an index in monitoring AML prognosis.

　　Key words: acute myeloid leukemia; Wnt3 geme; gene expression

　　Wnt3基因首次发现于小鼠的乳腺癌细胞，将小鼠乳腺癌病毒插入Wnt3基因位点附近可以诱导乳腺癌的发生。人类的Wnt3基因定位于17号染色体长臂(17q21)[1]，在急性髓系白血病(AML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者以及乳腺癌﹑卵巢癌细胞株中表达增加。本实验采用实时定量PCR(real-time PCR)方法检测Wnt3基因在40例AML患者中的表达，并分析其意义。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 实验组 2007年6月—2008年6月徐州医学院附属医院血液科住院和门诊AML患者40例(初诊30例，复发10例)。其中M2 15例，M3 6例，M4 8例，M5 11例。男20例，女20例，中位年龄36(11～76)岁。10例初诊AML患者随访其缓解前后骨髓，随访中位时间1(0.5～3)个月。所有患者经过骨髓细胞形态学、组织化学染色、免疫表型、分子生物学、细胞遗传学等检查确诊。完全缓解(CR)指临床、血象及骨髓细胞学缓解，未缓解指部分缓解(PR)和未缓解(NR)。

　　1.1.2 正常对照组 10名，男4名，女6名，中位年龄32(24～48)岁，均为缺铁性贫血患者和造血干细胞移植供者。

　　1.2 主要试剂、仪器 Trizol抽提试剂盒(BBI公司)、AMV逆转录酶试剂盒(TOYOBA公司)、Taq DNA聚合酶试剂盒(纽英伦生物技术有限公司)、dNTPs(SANGON公司)、DAN Ladder(MBI公司)、SYBR Premic Ex Taq试剂盒(TOYOBA公司)、DEPC(AMRESCO公司)、PE-2400 PCR基因扩增仪(ABI公司)、Real-time 7500荧光定量PCR仪(ABI公司)。

　　Wnt3引物序列(扩增产物147 bp,退火温度59℃)：上游5′-ACGCTGACTTCGGCGTGTTAG-3′;下游5′-CGTGGCACTTGCATTTGAGG-3′。

　　内对照2,3-二羟基丙醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列(扩增产物203 bp,退火温度57℃)：上游5′-TGTTGCCATCAATGACCCC-3′;下游5′-ACTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

　　1.3 方法

　　1.3.1 骨髓单个核细胞(MNC)的分离 无菌条件下抽取骨髓2 ml，肝素抗凝，用等体积的Ficoll淋巴细胞分离液，分离出MNC，用1×PBS洗涤2次，取5×107个细胞，-80℃冻存备用。

　　1.3.2 总RNA的提取 细胞总RNA由Trizol抽提试剂盒提取，按Trizol抽提试剂盒说明书进行，所提总RNA经分光光度计测定光密度(D)，D260/D280值在1.8～2.0者用于real-time PCR检测。

　　1.3.3 cDNA第一链的合成 20 μl反应体系包括：5×RT Buffer 4 μl,2.5 mmol/L dNDP 2 μl,Oligo(dT)18 1 μl,RNA Simple 3 μl,AMV逆转录酶2 μl，补无核酶水至20 μl。反应条件为30℃ 10 min,42℃ 60 min,99℃ 5 min灭活逆转录酶。cDNA于-20℃保存。

　　1.3.4 制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板 选择表达Wnt3基因的cDNA模板进行PCR反应，25 μl反应体系包括：2.5 mmol/L dNTP 2.5 μl,10×PCR缓冲液2.5 μl,Taq DNA聚合酶1 U,上下游引物各1 μl,cDNA 1 μl,加水至总体积25 μl。采用的循环参数为:95℃预变性 5 min,35个PCR循环(94℃，30 s;退火温度，20 s;72℃，30 s), 72℃延伸5 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物为单一特异性扩增条带;同样的方法获得GAPDH的扩增条带(图1)。将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为108，分别稀释为1×108、1×107、1×106、1×105这几个梯度浓度的DNA。

　　1.3.5 进行real-time PCR反应 50 μl real-time PCR反应体系包括:SYBR Premix Ex Taq 25 μl,上下游引物各1 μl,cDNA或DNA 1 μl,补水至总体积为50 μl。GAPDH：95℃，10 s;40个PCR循环(95℃，3 s;60℃，20 s;72℃，36 s);溶解曲线(95℃，15 s;60℃，1 min;95℃，15 s)。Wnt3：95℃，10 s;40个PCR循环(95℃，3 s;59℃，20 s;72℃，36 s);溶解曲线(同上)。

　　1.3.6 检测指标的计算 各样品的目的基因(Wnt3)和管家基因(GAPDH)分别进行real-time PCR反应。根据绘制的浓度梯度稀释DNA标准曲线，对各样品的目的基因和管家基因进行定量。每个样品的Wnt3浓度除以GAPDH的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。

　　1.4 统计学处理 用SPSS 13.0统计分析软件分析实验数据，rea-time PCR实验结果半定量比值以±s表示、阳性率以百分比(%)表示，两均数进行t检验, 多组均数进行单因素方差分析,两配对均数进行配对t检验，率的比较进行χ2 检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 Wnt3在AML患者中的表达 10例正常人检测到较低水平Wnt3基因的表达。初诊、复发组的Wnt3表达均比正常对照组升高，差异有显著性(P<0.05)。复发组和初诊组相比较，Wnt3基因的表达水平差异无显著性(P> 0.05)。见表1。表1 3组Wnt3基因的表达正常对照组比较：▲P<0.05

　　2.2 Wnt3基因表达与AML临床特征的关系 AML患者不同年龄、性别以及初诊白细胞数间Wnt3的表达差异均无显著性(P> 0.05)。见表2。

　　2.3 Wnt3基因表达与AML临床疗效的关系 30例初诊AML患者经1～2个疗程诱导缓解治疗完全缓解率为70%。根据正常对照组Wnt3表达水平95%可信区间上限(0.1142),将初诊组分为Wnt3高、低表达组, 高表达组23例中14例获完全缓解,完全缓解率为60.9%,低表达组中7例均获完全缓解，完全缓解率7/7,低表达组的完全缓解率高于高表达组(P=0.048)。表2 Wnt3基因表达与AML临床特征的关系

　　2.4 10例初诊AML患者缓解前后Wnt3基因的表达 随访10例初诊AML患者，其Wnt3基因平均表达水平由初诊时的(0.5998±0.1290)降低到缓解后的(0.0875±0.0377)，两者的差异有显著性(配对样本t检验，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　Wnt信号通路的异常是许多肿瘤发生的标志。Wnt信号通路的破坏复合体组成成分如腺瘤性结肠息肉病基因(APC)和Axin基因的突变，能够引起β-catenin的核内转移和肿瘤的发生[2]。虽然Wnt信号通路的异常在AML发生中的作用已经明确[3]，但是至今未检测到Wnt信号通路的破坏复合体成分在AML中发生变异，表明其他的机制可能介导了Wnt信号通路在AML中的异常。最近的研究发现，某些恶性血液病存在Wnt自分泌环，即通过上调Wnt信号通路上游分子来活化Wnt/β-catenin信号通路。例如：携带E2A-PBX1易位基因前B淋巴细胞白血病，可以通过上调Wnt16基因的表达而导致疾病的发生[4]。同样，多发性骨髓瘤高表达Wnt5a、Wnt10b和Wnt16可引起β-catenin的活化及核内转移[5]。由于AML患者高表达Wnt信号通路的上游分子，提示AML有可能通过自分泌环的方式异常激活Wnt信号通路。

　　已有报道Wnt3在AML患者中高表达[6]，然而该研究样本量偏小，仅16例，且平均年龄只有11岁。为了进一步明确Wnt3基因在AML中的表达，我们使用real-time PCR方法检测Wnt3基因在30例初诊AML患者中的表达。研究发现Wnt3基因在初诊AML患者中表达水平明显增加，这与以往的研究相一致[6]。提示AML可能通过自分泌Wnt3基因激活Wnt/β-catenin信号通路并且导致疾病的发生。Wnt3基因的表达水平与患者的年龄、性别无关，但是复发组表达增加。白血病的复发与白血病集落形成细胞即白血病干细胞密切相关。因为普通化疗药物不能杀灭白血病干细胞，化疗后残存的白血病干细胞可以重新生成白血病细胞，导致白血病的复发[7]。Wnt通路的关键因子β-catenin与白血病细胞的集落形成潜能有关，表达β-cantenin的AML细胞具有白血病干细胞的特性[8]，说明Wnt信号通路参与了白血病干细胞的维持。我们的研究显示，复发AML患者高表达Wnt3，提示Wnt3可能与白血病干细胞的维持有关，阻断Wnt3有可能成为治疗复发AML的新方法。

　　10例初诊AML患者经诱导达缓解后Wnt3基因表达明显降低。Wnt3基因在缓解后表达减少，复发时表达增加，可能的原因是诱导治疗完全缓解后，AML患者骨髓内表达Wnt3基因的白血病细胞减少，而复发后又增多。因此，Wnt3基因可能作为一个检测AML微小残留病(MRD)的指标。我们还发现Wnt3基因高表达组患者的缓解率较低，提示Wnt3基因可能与AML不良预后有关。

　　【参考文献】

　　[1] Roelink H, Wang J, Black DM, et al. Molecular cloning and chromosomal localization to 17q21 of the human Wnt3 gene [J]. Genomics,1993,17(5):790-792.

　　[2] Reya T, Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer [J]. Nature,2005,434(14):843-850.

　　[3] Simon M, Grandage VL, Linch DC, et al. Constitutive activation of the Wnt/β-catenin signalling pathway in acute myeloid leukaemia [J]. Oncogene, 2005, 24(2):2410-2420.

　　[4] McWhirter JR, Neuteboom ST, Wancewicz EV, et al. Oncogenic homeodomain transcription factor E2A-Pbx1 activates a novel WNT gene in pre-B acute lymphoblastoid leukemia [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(9):11464-11469.

　　[5] Derksen PW, Tjin E, Meijer HP, et al. Illegitimate WNT signaling promotes proliferation of multiple myeloma cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(16):6122-6127.

　　[6] Memarian A, Tehrani MJ, Vossough P, et al. Expression profile of Wnt molecules in leukemic cells from Iranian patients with acute myeloblastic leukemia [J]. Iran J Immunol,2007,4(3):145-154.

　　[7] Mikesch JH, Steffen B, Berdel WE, et al. The emerging role of Wnt signaling in the pathogenesis of acute myeloid leukemia [J]. Leukemia,2007,21(4): 1638-1647.

　　[8] Ysebaert L, Chicanne G, Demur C, et al. Expression of β-catenin by acute myeloid leukemia cells predicts enhanced clonogenic capacities and poor prognosis [J]. Leukemia,2006,20(10):1211-1216.