骨髓间充质干细胞接种小鼠肝癌组织对小鼠生存期的影响

　　【摘要】 目的 研究骨髓间充质干细胞(MSC)接种于原发性肝癌Heps荷瘤小鼠对其生存期的影响。方法 体外贴壁培养法制备昆明小鼠骨髓MSC，分离培养传代扩增，流式细胞仪鉴定MSC表型。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI)对MSC进行标记备用。随机取54只8周龄昆明小鼠，建立Heps肝癌移植瘤模型。移植瘤长径达0.5～0.8 cm时，随机分为MSC组、DAPI标记MSC组(DAPI组)、生理盐水(NS)对照组(NS对照组)，每组18只。MSC组及DAPI组分别在小鼠Heps肝癌移植瘤内注射2×106 MSC及DAPI标记的MSC，NS对照组注射同体积的NS。每组各有6只荷瘤小鼠用于观察生存期。①自注射日起，隔日测量各组小鼠肿瘤长、短径，计算注射后3、7、14及28天的肿瘤体积;②记录注射当天开始至小鼠死亡的时间，计算各组小鼠平均生存时间;③于注射后3、7、14及28天，各组分批处死3只小鼠。取肿瘤组织，石蜡包埋并切片，苏木精-伊红染色后光学显微镜观察。结果 ①体外贴壁法成功制备MSC，流式细胞仪对第3代MSC进行鉴定，高表达CD29(97.84%)，低表达CD34(5.56%)、CD45(7.66%)。②小鼠Heps肝癌腹水瘤细胞成功制备小鼠Heps肝癌移植瘤模型，成瘤率100%。③注射MSC后1周，MSC组及DAPI组肿瘤体积增大明显，与NS对照组差异有显著性(P<0.05)。④MSC组平均生存期为45天(95%可信区间：33～56天)，DAPI组平均生存期为34天(95%可信区间：31～37天)，NS对照组平均生存期为33天(95%可信区间：28～37天);MSC组与NS对照组差异有显著性(P<0.05)，其余组间生存期差异无显著性(P>0.05)。⑤各组小鼠肿瘤苏木精-伊红染色：28天时，MSC组及DAPI组肿瘤组织坏死明显，范围较NS对照组更大。结论 MSC可在原发性肝癌Heps荷瘤小鼠肿瘤组织内定植，MSC接种后1周内肿瘤增长迅速，小鼠生存期延长。

　　【关键词】 肝肿瘤，实验性;间充质干细胞;Heps肝癌;小鼠

　　Impact of inoculation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into

　　hepatocellular carcinoma tissue on survival time in mice with

　　orthotopic hepatocellular carcinoma

　　LV Xinlei1△， ZHANG Nanzheng1*， CHEN Fuxing2， LIU Junquan2， SUN Leiqing2

　　(1. Department of Gestroenterology and Oncology, The 97 Hospital of Chinese PLA,

　　Xuzhou, Jiangsu 221004, China; 2. Biological Therapy Center, The 97 Hospital of Chinese PLA)

　　Abstract:Objective To investigate the impact of mesenchymal stem cells (MSC) inoculated into the established model of Heps-bearing mice on survival time. Methods MSC were obtained through adherent culture method. Phenotypes of MSC were analyzed by flow cytometry. MSC were labeled with DAPI in vitro. We developed 54 mice with subcutaneously transplanted liver carcinomas. When the maximal diameters of the tumor reached 0.5-0.8 cm, the mice were randomly divided into three groups (n=18 each): MSC group， MSC labeled with DAPI group (DAPI group)， Normal saline (NS) control group (NS control group). MSC and MSC marked by DAPI were all administrated into the mouse right rear back tumor tissue of 2×106. The NS control group were administrated with the same volume of NS. 6 mice in each group were used to observe the survival time. ① The size of the implanted tumors was measured every 2 days and the tumor volume was calculated on 3th, 7th, 14th and 28th day. ② The survival time of the tumor-bearing mice was recorded and the mean survival time was calculated. ③ 3 mice from each group were sacrificed at 3th, 7th, 14th and 28th day after inoculation respectively. Tumor tissue samples collected at above 4 time points were imbedded in paraffin for routine pathological section, hematoxylin-eosin staining and light microscopy observation. Results ① Purified MSC were successfully obtained through adherent culture method. Passage 3 cells were collected and analyzed by flow cytometry. The results showed that MSC CD29 (97.84%)was positive, whereas, CD34 (5.56%) and CD45 (7.66%) were negative. ② The model of Heps-bearing mice were successfully established and the rate of tumor formation is 100%. ③ At the first week after MSC were administrated, the volume of the tumors was markedly increased in the MSC group and the DAPI group compared with the NS control group (P<0.05). ④ In the MSC group, the mean survival time was 45 days (95% confidence interval: 33-56 days); in the DAPI group, the mean survival time was 34 days (95% confidence interval: 31-37 days); in the NS control group, the mean survival time was 33 days (95% confidence interval: 28-37 days). There was statistical difference between the MSC group and the NS control group (P<0.05). However, there was no statistical sigificant difference in the other groups (P>0.05). ⑤ At 28th day after MSC were administrated, there were larger areas of necrosis and angiolysis in the MSC group and the DAPI group than in the NS control group. Conclusions MSC can engraft in tumor transplantation of Heps-bearing mice. In the first week, the volume of tumor in the MSC group is increased quickly. The survival time of Heps-bearing mice is prolonged.

　　Key words： liver neoplasms, experimental; mesenchymal stem cells; Heps hepatoma; mice

　　骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是骨髓内除造血干细胞和多功能前祖细胞外另一种成体干细胞，它来源于中胚层，主要存在于全身结缔组织器官间质和骨髓组织中。研究发现，MSC易于体外培养、传代，自我更新能力强，具有多向分化潜能，同时免疫原性低、有肿瘤趋向性[1-2]。目前MSC在药物性肝损害和脑胶质瘤的动物实验模型中显示出一定的治疗效果[3-4]，但MSC能否用于原发性肝癌的治疗?它与原发性肝癌之间存在什么样的关系?目前缺乏相关研究。我们利用小鼠Heps肝癌瘤源腹水制备昆明小鼠Heps肝癌移植瘤模型，通过贴壁培养法制备MSC，将其接种于小鼠原位肝癌模型，观察MSC接种后对原发性肝癌Heps荷瘤小鼠生存期的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 昆明小鼠，SPF级，雄性，6～8周龄，体重20～25 g，购自徐州医学院实验动物中心。

　　1.2 主要试剂 小鼠骨髓MSC完全培养基购自Cyagen公司;藻红素(phycoerythrin, PE) 抗小鼠CD45(Leukocyte Common Antigen, Ly-5)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)抗小鼠CD34、PE抗小鼠 CD29PE-Cy5购自eBioscience公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)购自碧云天生物技术研究所;小鼠Heps肝癌细胞株(瘤源腹水保种)由中国科学院上海药物研究所提供，江苏省肿瘤防治研究所传代保种。

　　1.3 方法

　　1.3.1 MSC的分离培养及扩增 选取8周龄的雄性昆明小鼠颈椎脱臼法处死，无菌取胫骨和股骨，用培养基冲出骨髓，直至骨干变白为止。200目细胞筛过滤，轻柔吹打制成单细胞悬液，将细胞以1×106/cm2密度接种于含MSC完全培养基的6孔培养板中培养，在37℃、5% CO2培养箱中孵育。72 h首次换液，弃去非贴壁细胞，贴壁细胞用培养液洗2遍,以后每3天全量换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。取第3代细胞用于细胞表面标志的鉴定和本实验小鼠接种移植。

　　1.3.2 MSC细胞表面标志的鉴定 培养细胞达80%～90%融合后，用0.125%胰蛋白酶/0.05% EDTA消化，磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次。将细胞重悬，以每份样品1×105细胞平均分配于流式管中，分别加入5 μl PE标记的抗小鼠CD29、CD45和2 μl FITC标记的抗小鼠CD34，室温避光孵育20 min，每管中加2 ml PBS，打匀，1500 r/min离心4 min，倒掉上层液体，加500 μl PBS悬浮，上机检测。

　　1.3.3 DAPI标记MSC 取第3代MSC细胞，弃培养液，加入5 ml DAPI染色液，混匀，室温放置5 min，吸取DAPI染色液，PBS洗涤3次，每次5 min，直接在荧光显微镜下观察。

　　1.3.4 小鼠Heps肝癌移植瘤模型的建立 无菌操作取传代保种10天、生长旺盛且无破溃的小鼠Heps肝癌瘤源腹水，用生理盐水(NS)稀释制成肿瘤细胞悬液，计数并调节细胞密度为1×1010/L，每只0.1 ml接种于小鼠右后背侧皮下。移植瘤直径达0.5～0.8 cm时，将模型鼠随机分为3组(每组18只)：①MSC接种组，以下简称MSC组;②DAPI标记MSC接种组，以下简称DAPI组;③NS对照组。其中，每组各有6只单独用于观察生存期。

　　1.3.5 MSC的体内种植 将实验培养的第3代MSC，调整细胞密度为2×1010/L，平均分成2份：一份为MSC组，一份用DAPI进行标记(方法同1.3.3)，直视下在原发性肝癌Heps荷瘤小鼠背部瘤体内分别注入0.1 ml的MSC及DAPI标记的MSC，NS对照组注射同体积的NS。

　　1.3.6 荧光冰冻切片追踪荷瘤小鼠体内DAPI标记的MSC 于注射后7天取DAPI组荷瘤小鼠移植瘤组织，4%多聚甲醛溶液固定过夜，流水漂洗24 h，梯度蔗糖脱水，连续冰冻切片，厚度15 μm，荧光显微镜下观察DAPI阳性细胞。

　　1.4 观察指标 ①倒置显微镜下观察MSC形态及生长情况;② 流式细胞仪鉴定MSC表型;③荧光显微镜观察体外DAPI标记MSC及肿瘤组织内DAPI标记MSC;④各组小鼠自注射日起，隔日用游标卡尺测量瘤体最大径(a)和最小径(b)，按以下公式计算肿瘤体积(V):V=1/2(a×b2), 比较接种后3、7、14及28天肿瘤体积的变化;⑤记录注射当天开始至小鼠死亡的时间;⑥各组于注射后3、7、14及28天分批处死3只小鼠，瘤组织取材，10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，病理组织切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察。

　　1.5 统计学处理 计量资料以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计学处理。组间比较采用单因素方差分析，用Kaplan-Meier法进行生存分析，P<0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 小鼠骨髓MSC的分离培养与鉴定 原代培养的MSC于接种后3天左右开始贴壁，弃悬浮细胞后，继续培养至4天时出现分散存在的细胞克隆，以长梭形为主，少数为三角形或扇形;2周左右细胞达90%融合。消化传代的细胞于3天内完全贴壁，形态与原代细胞相似，连续传3代，仍增殖旺盛(图1)。

　　2.2 流式细胞仪鉴定MSC表型 流式细胞仪分析结果显示，MSC高表达CD29(97.84%)，低表达CD34(5.56%)、CD45(7.66%)。

　　2.3 荧光显微镜观察体外DAPI标记的MSC及荧光冰冻切片追踪荷瘤小鼠肿瘤组织中DAPI标记的MSC 荧光显微镜下观测到DAPI标记的MSC，胞核呈明亮蓝色荧光(图2～5)。

　　2.4 各组小鼠肿瘤体积变化情况 小鼠Heps肝癌腹水瘤细胞成功接种于到昆明小鼠背侧皮下，10天后移植瘤长径达0.5～0.8 cm，成瘤率100%。MSC组及DAPI组荷瘤小鼠移植瘤在注射MSC后1周内增长迅速，与NS对照组比较有显著差异(P<0.05)。注射MSC 1周后，各组小鼠肿瘤体积均较前增大，但差异无显著性(P>0.05)，结果见表1。注射MSC 1周内，各组小鼠精神状态均较注射前差，进食少;注射1周后，MSC组及DAPI组荷瘤小鼠一般状况好转，精神相对饱满，毛色顺滑，进食旺盛，肿瘤进行性增大，至28天时，肿瘤表面坏死及出血较严重;NS对照组毛色不顺，精神萎靡，进食少，肿瘤也呈进行性增大，至28天时，肿瘤表面有部分坏死，无明显出血。

　　2.5 各组小鼠生存曲线及生存时间比较 注射MSC后49天时，MSC组仍有2只荷瘤小鼠存活，平均生存期为45天(95%可信区间:33～56天)，生存期明显延长，而DAPI组及NS对照组荷瘤小鼠全部死亡，生存期分别为28～39天及25～39天，平均生存期为34天、33天(95%可信区间:31～37天、28～37天);其中，MSC组与NS对照组差异有显著性(P<0.05)，其余各组间比较差异无显著性(P>0.05)(图6)。表1 注射MSC后各组小鼠肿瘤体积的变化

　　2.6 各组小鼠肿瘤组织苏木精-伊红染色 注射后28天，MSC组及DAPI组肿瘤细胞形态消失，呈凝固性坏死，组织结构不清，坏死明显，范围较NS对照组更大(图7，8)。

　　3 讨 论

　　研究发现，MSC在体外对淋巴细胞有抑制作用[4-7]，对黑色素瘤细胞A375SM[8]和乳腺癌细胞MCF-7[9]有促进增殖的作用，可以促进小鼠移植肿瘤的形成。本实验发现，MSC注射后第1周，MSC组及DAPI组肿瘤体积增长迅速，小鼠一般状况好于NS对照组，进食好，精神佳，而NS对照组进食相对较差，精神萎靡或烦躁。随后MSC组和DAPI组肿瘤增长速度减慢，至MSC注射后第14、28天时，各组肿瘤体积均较前增大，但差异无显著性(P>0.05)。

　　MSC组荷瘤小鼠早期肿瘤生长迅速的原因不明，MSC的免疫抑制作用可能是其主要原因。Djouad等[10]对免疫功能正常的小鼠单独接种异基因B16黑色素瘤细胞后观察到，受体产生免疫排斥，不能形成肿瘤，而在MSC存在的情况下，MSC无论与肿瘤细胞共同接种，还是在远离肿瘤处皮下注射，均可形成肿瘤。Djouad认为这是因为MSC存在免疫抑制，促进了肿瘤细胞生长。另外MSC自身缺乏特异性，具有多样分化潜能和分泌功能，它在一定情况下可分化成各种基质细胞，形成肿瘤细胞生长的微环境，并分泌多种细胞因子和生长因子促进肿瘤细胞的生长，具体机制有待进一步研究。

　　在生存期方面，观察至MSC种植后49天时，DAPI组及NS对照组荷瘤小鼠全部死亡，生存期分别为28～39天、25～39天，平均生存期为34天、33天(95%可信区间:31～37天、28～37天);而MSC组在种植后49天时仍有2只荷瘤小鼠存活，平均生存期为45天(95%可信区间:33～56天)，生存期明显延长，说明在肿瘤内输注MSC后延长了荷瘤小鼠的生存期，但其他组间差异无显著性(P>0.05)，可能与每组荷瘤小鼠仅为6只，样本数太少有关，今后将进一步扩大样本数进行实验。

　　MSC延长荷瘤小鼠生存期的机制目前尚不完全明确，MSC可能通过多种机制抑制肿瘤细胞生长，从而延长了荷瘤小鼠的生存期。研究发现，MSC可分泌多种生长因子、细胞因子影响肿瘤细胞生长。MSC可以产生多种神经营养因子，包括神经生长因子(NGF)，从而在体外诱导C6胶质瘤细胞的分化并抑制其增殖，NGF还可通过抑制神经元凋亡发挥神经保护作用，延长荷胶质瘤鼠生存期[11-12]。MSC可分泌大量血管生成因子，如血管生成素1(angiopoietin 1， Ang-1)，Ang-1在体内可抑制肿瘤血管渗漏和肿瘤生长[13]。MSC的抗肿瘤作用也可能通过增加免疫活性和诱导凋亡来实现，MSC可抑制9L脑胶质瘤细胞生长，IL-2、IL-15、粒-巨噬细胞集落刺激因子等活化MSC后，其作用更明显[14]。MSC还可通过调节诱导肿瘤细胞基因表达而抑制其增殖。在Kaposi肉瘤小鼠模型中静脉输注MSC，结果显示MSC可聚集到肿瘤处，并以剂量依赖的方式抑制肿瘤生长。其在体内的抑瘤作用与其抑制靶细胞Akt蛋白激酶活性有关。MSC与Kaposi肉瘤细胞体外共培养，可抑制Kaposi肉瘤细胞Akt蛋白激酶活性，这种抑制作用需要MSC与肿瘤细胞直接接触，加入E-钙黏蛋白中和抗体，可消除MSC对靶细胞Akt蛋白激酶活性的抑制作用，表明E-钙黏蛋白可能具有重要作用。同时MSC与靶细胞相互作用后也存在旁分泌作用，表现为与MSC非直接接触的Kaposi肉瘤细胞中磷酸化Akt水平下降[15]。研究发现MSC能分化为分泌白细胞的肝细胞样细胞,改善部分小鼠肝脏功能，Kuo等[16]用四氯化碳诱导非肥胖型重度糖尿病联合免疫缺陷小鼠发生致死性爆发性肝衰竭,然后经脾或经静脉途径移植不同剂量的由MSC分化的肝细胞或MSC，结果显示，由MSC分化的肝细胞组和MSC组，通过经脾或经静脉两种途径,都定植于小鼠肝脏，分化为有功能的肝细胞，挽救了肝衰竭;而且，MSC组在体外对活性氧自由基具有更强的抵抗力，降低了受体小鼠的氧化应力，在肝脏受损后加速了肝细胞再生。因此认为，骨髓MSC移植能有效地挽救实验性肝衰竭，促进肝再生，将来可能替代治疗终末期肝病的肝移植。Molloy等[17]将乳腺癌细胞与MSC共培养后，发现MSC分泌大量细胞因子，包括IL-6、组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)、趋化因子配体-2(CCL-2)等，其中分泌的CCL-2比对照组明显增多(P<0.05)，并抑制了21%～50%乳腺癌细胞的生长。Nakamura等[4]发现MSC主要位于肿瘤边缘，形成被囊样结构，这种独特的MSC分布可能形成一种屏障防止肝癌细胞进入正常的肝组织内。以上的事例提示了MSC的部分抗肿瘤效应，MSC在原发性肝癌中的作用机制相当复杂，今后需要更深入的研究。

　　【参考文献】

　　[1] Colter DC, Class R, DiGirolamo CM, et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-dadherent cells from human bone marrow [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(7): 3213-3218.

　　[2] Grinnemo KH, Mnsson A, Dellgren G, et al. Xenoreactivity and engraftment of human mesenchymal stem cells transplanted into infracted rat myocardium [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2004, 127(5): 1293-1300.

　　[3] Sato Y, Araki H, Kato J, et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human heaptocytes without fusion [J]. Blood, 2005, 106(2): 756-763.

　　[4] Nakamura K, Ito Y, Kawano Y, et al. Antitumor effect of genetically engineered mesenchymal stem cells in a rat glioma model [J]. Gene Ther, 2004, 11(14): 1155-1164.

　　[5] Djouad F, Plence P, Bony C, et al. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals [J]. Blood, 2003, 102(10):3837-3844.

　　[6] Kim DH, Yoo KH, Choi KS, et al. Gene expression profile of cytokine and growth factor during differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cell [J]. Cytokine, 2005, 31(2):119-126.

　　[7] Sato H, Kuwashima N, Sakaida T, et al. Epidermal growth factor receptor-transfected bone marrow stromal cells exhibit enhanced migratory response and therapeutic potential against murine brain tumors [J]. Cancer Gene Ther, 2005, 12(9):757-768.

　　[8] Studeny M, Marini FC, Dembinski JL, et al. Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeted-delivery vehicles for anticancer agents [J]. J Natl Cancer Ins, 2004, 96(21):1593-1603.

　　[9] Fierro FA, Sierralta WD, Epuan MJ, et al. Marrow-derived mesenchymal stem cells: role in epithelial tumor cell determination [J]. Clin Exp Metastasis, 2004, 21(4):313-319.

　　[10] Djouad F, Plence P, Bony C, et al. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals [J]. Blood, 2003, 102(10): 3837-3844.

　　[11] Khakoo AY, Pati S, Anderson SA, et al. Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi′s sarcoma [J]. J Exp Med, 2006, 203(5): 1235-1247.

　　[12] Kimura S, Yoshino A, Katayama Y, et al. Growth control of C6 glioma in vivo by nerve growth factor [J]. J Neurooncol, 2002, 59(3): 199-205.

　　[13] Stoeltzing O, Ahmad SA, Liu W, et al. Angiopoietin-1 inhibit vascular permeability, angiogenesis, and growth of hepatic colon cancer tumors [J]. Cancer Res, 2003, 63(12): 3370-3377.

　　[14] Kang SG, Jeun SS, Lim JY, et al. Cytotoxicity of rat marrow stromal cells against malignant glioma cells [J]. Childs Nerv Syst, 2005, 21(7): 528-538.

　　[15] Khakoo AY, Pati S, Anderson SA, et al. Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi′s sarcoma [J]. J Exp Med, 2006, 203(5): 1235-1247.

　　[16] Kuo TK, Hung SP, Chuang CH, et al. Stem cell therapy for liver disease: parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Gastroenterology, 2008, 134(7): 2111-2121.

　　[17] Molloy AP, Martin FT, Dwyer RM, et al. Mesenchymal stem cell secretion of chemokines during differentiation into osteoblasts, and their potential role in mediating interactions with breast cancer cells [J]. Int J Cancer, 2009, 124(2):326-332.