Ro25-6981对成年脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区神经发生的影响

　　【摘要】 目的 探讨NMDA受体亚单位2B选择性拮抗剂Ro25-6981对成年大鼠短暂性全脑缺血再灌注后海马CA1区神经发生的影响。方法 将成年雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组。制作四动脉阻断(4AO)大鼠全脑缺血15 min再灌注模型。实验组和对照组大鼠分别于术前30 min腹腔注射不同剂量Ro25-6981(0.3 mg/kg、0.6 mg/kg)、生理盐水。免疫组织化学技术显示再灌注第1、3、7天各组大鼠海马CA1区BrdU阳性细胞数。结果 对照组大鼠BrdU阳性细胞在再灌注3 d增殖达高峰，随后下降。 再灌注1、3、7天，实验组与对照组相比BrdU阳性细胞数均明显减少(P<0.01)。结论 一定条件下，Ro25-6981可抑制缺血再灌注诱导的海马CA1区的短暂性神经发生。

　　【关键词】 脑缺血/再灌注;NMDA受体拮抗剂;神经发生;大鼠

　　The effect of Ro25-6981 on the neurogenesis in adult rat hippocampus following

　　transient forebrain ischemia/reperfusion

　　WANG Shanshan1, HU Zhonghao1, XU Tiejun2*

　　(1.Department of Histology and Embryology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2.Department of Human Anatomy, Xuzhou Medical College)

　　Abstract: Objective To investigate the effect of the selective antagonist Ro25-6981 of NMDA receptor subunit 2B (NR2B) on the neural recovery in adult rat hippocampus after transient forebrain ischemia/reperfusion (I/R). Methods The male SD rats were randomized into three groups: the experiment groups (Ⅰand Ⅱ) and the control group. The rats in the experiment groups and the control group were subjected to 15 min of 4-artery occlusion (4AO) to establish the animal model of rat brain ischemia (15 min) and reperfusion. The rats in the experiment groups were intraperitoneally administered with Ro25-6981 at doses of 0.3 mg/kg and 0.6 mg/kg, respectively, while the same volume of NS was injected into the rats in the control group. Immunohistochemistry was employed to demonstrate and to compare the rate of BrdU positive cells in CA1 of hippocampus in different groups at 1 d, 3 d and 7 d. Results The control group: BrdU positive cells peaked at I/R 3 d and decreased until I/R 7 d in the CA1 region. The experiment groups: The numbers of BrdU-positive cells significantly decreased as compared to that in the control group. Conclusion Transient forebrain ischemia/reperfusion could induce neurogenesis in the CA1 region, while this kind of neurogenesis could be inhibited by Ro25-6981.

　　Key words: ischemia/reperfusion; NMDA receptor antagonist; neurogenesis

　　缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病和多发病。目前认为，当发生缺血缺氧时，刺激谷氨酸受体，尤其是引起NMDAR过度兴奋，导致神经细胞Ca2+超载而致损伤[1]。于是人们试图使用NMDAR拮抗剂缓解脑缺血引起的神经细胞死亡。

　　有研究表明NMDAR拮抗剂MK-801可刺激正常的成年大脑神经发生[2-3]。注射MK-801虽然可以防止短暂性局脑缺血后海马CA1区神经元的死亡，但同时也阻止了海马齿状回中缺血诱导的神经发生[4]。此外，NMDAR不仅在病理过程中起作用，也可能参与了众多的生理功能，使用NMDA受体拮抗剂会对其正常生理活动干扰过大。因此选择具有受体亚基选择性的拮抗剂，能够在较小剂量下产生定位靶向作用，减少副作用，提高安全性。

　　海马CA1区在脑缺血时的相对易损性使其成为研究缺血性脑损伤的理想对象。本课题组以往实验发现，NR2B蛋白质和mRNA在正常大鼠海马CA1区、CA3区及齿状回的免疫反应强度存在明显差异，CA1区最强，CA3区次之，齿状回着色较弱。这种基础性平行高表达可能是造成海马CA1区缺血易损性的原因之一[5]。

　　那么，NMDA受体亚单位2B(NR2B)选择性拮抗剂Ro25-6981对脑缺血/再灌注(I/R)后海马CA1区的作用如何呢?本实验旨在研究其对脑缺血后海马CA1区神经发生的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物和分组 成年雄性SD大鼠(徐州医学院实验动物中心提供)36只，体重(250±25) g，随机分为实验组(n=24)和对照组(n=12)。实验组大鼠于术前30 min腹腔内注射不同剂量Ro25-6981(0.3 mg/kg、0.6 mg/kg)，对照组在术前30 min注射等容量(5 ml)的生理盐水。大鼠分别在注射Ro25-6981或生理盐水后第1天、3天和7天各处死4只。所有大鼠于处死前1天在12 h内每4 h腹腔注射BrdU 50 mg/kg，共3次。

　　1.2 前脑缺血/再灌注模型的制备 按照Pulsinelli的四血管阻断法进行：10%水合氯醛(0.35～0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，从颈前分离出双侧颈总动脉,并分别套以丝线(不结扎)，再经第1颈椎双侧横突翼孔电凝灼断双侧椎动脉。24 h后，大鼠不予麻醉,直接仰置固定于手术台上，在清醒状态下用动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉，15 min后松开动脉夹，确认双侧颈总动脉再灌流后关闭切口。手术过程中持续进行肛温监测，并用白炽灯照射的方法维持大鼠体温恒定。符合以下条件的大鼠入选缺血再灌注组：①动脉夹闭60 s内，大鼠翻正反射消失;②双侧瞳孔持续开大，轻触条件下角膜反射消失;③肛温稳定在36℃～37℃范围内。

　　1.3 切片制备 动物用10%水合氯醛(0.35～0.40 ml/100 g)腹腔注射麻醉，经心脏升主动脉插管，快速灌注80～100 ml生理盐水后，再灌注4%多聚甲醛300 ml，前100 ml快灌，后200 ml慢灌，30 min内灌完。灌注后的大鼠断头、暴露脑，在立体定位仪上，将鼠脑冠状位分成前、中、后3段。取含有海马的中段放入4%多聚甲醛，过夜固定。脑组织块自4%多聚甲醛取出后，进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。然后将脑块作连续冠状切片，片厚6 μm，将每只大鼠海马的全部切片按相同间隔顺序分成3套(焦油紫染色1套、免疫组化1套，阴性对照1套)。

　　1.4 焦油紫染色 脱蜡、复水;焦油紫染色，6 min;双蒸水洗，10 s;依次经过乙醇分色，时间依蓝化程度而定;脱水、透明、封片。

　　1.5 免疫组织化学反应 切片用铅笔做记号，按下列步骤进行BrdU的免疫组织化学反应。反应步骤如下：①梯度乙醇脱蜡、复水，PBS漂洗;②3%H2O2处理10 min灭活内源性酶，双蒸水洗;③切片于枸橼酸钠溶液中微波抗原修复：高火2 min，低火持续15 min，自然冷却，PBS漂洗;④加BSA封闭液37℃孵育箱，1 h;⑤取后甩干，滴加BrdU小鼠单克隆抗体(1∶500，Sigma公司)，4℃过夜，PBS冲洗;⑥37℃复温1 h;⑦冷却至室温后，PBS冲洗，甩干后，加生物素化山羊抗小鼠IgG(武汉博士德)，37℃，30 min;⑧冷却至室温后PBS冲洗;⑨滴加试剂SABC(武汉博士德)，37℃，30 min;⑩冷却至室温后，0.01 mol/L PBS冲洗，5 min×4次;DAB显色，显色时间以在显微镜下观察为准，及时终止反应;脱水，透明，封片。阴性对照切片用0.1% TritonX-100代替一抗孵育，其他反应步骤相同。

　　1.6 图像分析 采用目镜带有网格尺(10 mm×10 mm)的显微镜(目镜10×、物镜40×)观察，每只大鼠取4张脑片进行分析，每张脑片从海马CA1区取5个不同视野，计数标尺内的阳性细胞数。然后计算每张脑片CA1区的平均阳性细胞数=阳性细胞总数×400/(10×10×5)。

　　1.7 统计学处理 数据以±s表示，组间比较行单因素方差分析(one-way ANOVA)。采用SPSS 13.0进行统计学处理。P<0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠海马焦油紫染色特征 焦油紫染色显示，短暂性前脑缺血后1天，即使是易损的海马CA1区也未见细胞数量和形态发生明显改变。缺血后3天，CA1区细胞胞体开始缩小，胞核固缩。出现坏死细胞，表现为细胞体积明显缩小，细胞固缩呈深紫色。CA3区可见少量的细胞胞体缩小，齿状回细胞形态和数量未见明显改变。缺血后7天，CA1区坏死细胞体积进一步缩小，呈“米粒”状散在分布于正常细胞之间(图1A～1C)。

　　图1 对照组海马CA1区，I/R 1天(A)未见异常细胞;I/R 3天(B)出现坏死细胞，胞体缩小;

　　I/R 7天(C)坏死细胞体积进一步缩小(焦油紫染色，标尺示60 μm )

　　2.2 短暂性前脑缺血后大鼠海马CA1 BrdU阳性细胞表达 免疫组织化学方法标记BrdU阳性细胞胞核为圆形，胞核着色，为棕黄色。再灌注后3天，对照组细胞增殖达高峰，BrdU标记阳性细胞数为(101.33±5.68)个/mm2。再灌注1天、3天和7天，注射0.3 mg/kg和0.6 mg/kg Ro25-6981的实验组与对照组比较BrdU阳性细胞数均显著减少(P<0.01)(表1，图2～图4)。表1 再灌后不同时间实验组与对照组大鼠海马CA1区BrdU阳性细胞数

　　3 讨 论

　　BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物,在细胞有丝分裂的S 期嵌入细胞核的DNA，因而BrdU 阳性细胞被看作是具有增殖活性的前体细胞[6]。Gage等[7]已证实使用BrdU 标记能更清楚地鉴定成年体内新增殖的细胞。以往实验发现脑缺血不同程度地促进成年大鼠脑内不同区域BrdU 阳性细胞的增加[8]。本实验发现短暂性前脑缺血15 min后，对照组海马CA1区BrdU 阳性细胞增多，再灌注1天开始增加，3天似乎达到一个高峰，7天时便有所下降，呈现缺血后短暂的增殖，但实验组在应用NMDAR亚单位2B拮抗剂Ro25-6981后，则可抑制脑缺血引起的这种细胞增殖。在相似的研究中，Bernabeu等[4]使用前脑缺血10 min模型，发现全身注射MK-801可阻止大量的CA1区神经元死亡以及缺血诱导的神经发生，和本实验结果一致。提示在这种前脑缺血的模型中降低谷氨酸受体的活化，可触发脑内的神经发生。

　　在脑缺血中，NMDAR拮抗剂如何会抑制缺血诱导的神经发生的机制不明，可能与调节缺血后引起的多种生长因子的级联变化水平有关。比如，短暂性局脑缺血可以引起单侧bFGF mRNA持续性的增多[9]，以及两侧海马BDNF mRNA的增多。前者是一种体外培养海马前体细胞的有丝分裂原[10]。脑室注射BDNF可增加成年大鼠嗅球内新生神经元的产生和(或)存活[11]。多种生长因子复合体的变化可通过NMDAR介导的谷氨酸机制进行调节。例如，谷氨酸在体外可增加NGF、BDNF和bFGF mRNA的量，而这种作用可被MK-801阻断[12-13]。NR2是NMDAR复合物的调节亚单位，Ro25-6981可能通过选择性拮抗NR2B，抑制NMDAR的部分功能从而发挥作用。

　　综上所述，本实验条件下的结果提示：一定条件下，阻断NMDAR亚单位2B可抑制缺血再灌注后大鼠海马CA1区的神经发生，其具体机制有待进一步研究。

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