RAD001对胃癌MKN-45细胞生长影响的实验研究

　　【摘要】 目的 探讨RAD001对胃癌细胞株MKN-45细胞生长的影响及可能作用机制。方法 体外培养MKN-45细胞，给予RAD001干预后通过细胞计数检测MKN-45细胞数目，流式细胞术检测细胞周期分布，Western-blot检测核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶(p70S6K)、真核起始因子4E(eIF-4E) 结合蛋白1(4E-BP1)、S6蛋白表达及磷酸化情况。结果 RAD001作用于MKN-45细胞24 h：RAD001对MKN-45细胞的生长产生抑制作用，抑制作用具有时间依赖性;MKN-45细胞细胞周期发生改变，停滞在G0-G1期细胞比例增加;MKN-45细胞的4E-BP1、p70S6K、S6无明显变化，phosphate-p70S6K、phosphate - S6表达缺失，phosphate 4E-BP1表达下降。结论 RAD001是通过抑制mTOR 下游通路阻断4E-BP1 及p70S6K的磷酸化和蛋白质翻译进而调节细胞周期以发挥抑制MKN-45细胞生长的作用。

　　【关键词】 胃癌;MKN-45细胞;RAD001; 细胞生长;抑制作用;机制

　　Experimental study of the effect of RAD001on gastric carcinoma cell line MKN-45

　　CAI Hongxing1, ZHU Zhengqiu2, ZHU Zu′an3

　　(1. Department of Forensic Medicine, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2. Department of Medical Oncology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002;

　　3. Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College)

　　Abstract: Objective To investigate the effect of RAD001 on gastric carcinoma cell line MKN-45 and to explore the possible mechanism. Methods Gastric carcinoma MKN-45 cell line were cultured in RPMI1640 with 10% fetal calf serum and treated by RAD001 (20 nmol/L); afterwards, the cell coulter, flow cytometry, western-blot array were used to detect the growth, cell cycle and protein expression of the tumor cells. Results Following RAD001 treatment, the MKN-45 cells were inhibited in a time-dependence manner. There were changes in the cycle of the MKN-45 cells, with an increase in the cell percentage of G0-G1 phase stagnation. Meanwhile, there were no marked changes in the expressions of eukaryotic translation initiation factors eIF-4E (eIF-4E) and phosphate-4E-BP1, ribosomal protein 40S kinase, and there was loss in the expression of phosphate-p70S6K and phosphate-S6, and the expression of phosphate 4E-BP1 was down-regulated. Conclusion RAD001 can inhibit the growth of gastric carcinoma cell line MKN-45 by the adjustment of cell cycle via inhibition of the downstream pathway of mTOR and the consequent blockage of the phosphorylation and protein translation of p70S6K and 4E-BP1.

　　Key words: gastric carcinoma; MKN-45 cell; RAD001; cell growth; inhibitory effect; mechanism

　　细胞生长和细胞增殖是相互不同但又相关的两个过程,它们在器官的生长、组织的形成及肿瘤的生长中起着重要的作用。mTOR(mammalian target of rapamycin)是雷帕霉素(rapamycin)的靶分子，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键性的作用[1]。mTOR信号通路调控异常与肿瘤发生密切相关，是肿瘤治疗的靶点[2-3]。RAD001为雷帕霉素的衍生物，为mTOR的抑制剂。本研究对RAD001对胃癌细胞株MKN-45细胞生长的影响及其机制进行了探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料和仪器 RAD001、胃癌细胞株MKN-45细胞为奥地利大学Volker Wachek博士馈赠。RAD001用二甲基亚砜(DMSO)配成1 mmol/L贮备液，实验时用RPMI 1640稀释为20 nmol/L。RPMI 1640、小牛血清购自美国GIBCO公司，其他试剂均为分析纯。PI染液、RNase购自美国BD Bioscience公司，p70S6K(9202，rabbit)、phosphate-p70S6K(9204，rabbit)、4E-BP1( 9452，rabbit)、phosphate-4E-BP1(9451，rabbit)、S6(2217，rabbit)、phosphate-S6(4838，rabbit)、Actin(4968，rabbit)购自美国Cell Signaling公司，1-block、CSPD、Assay buffer购自美国Tropix 公司，Marker购自美国Fermentas公司，型号00012835。细胞计数仪为美国Beckman公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品，电泳仪为美国Bio-Rad公司产品。

　　1.2 细胞培养及分组 细胞培养，生长分裂期细胞用于本实验研究。实验分为：①阴性对照组，干预药物为RPMI 1640;DMSO对照组，干预药物为DMSO;RAD组，干预药物为RAD001(20 nmol/L)。

　　1.3 指标检测

　　1.3.1 Western-blot检测 取生长分裂期MKN-45细胞，胰酶消化后置于6孔板内，每孔约1×105个细胞，体积5 ml， 24 h细胞附壁后移去所有上清，根据分组加入相应干预药物，每孔最终体积5 ml。于药物作用24 h后，反复冻溶后加入蛋白裂解液，收集细胞，提取蛋白，并行蛋白定量。取15 μg蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转至硝酸纤维膜上，分别加入一抗p70S6K(1∶1000)、 4E-BP1(1∶1000)、phosphate- p70S6K(1∶1000)、S6(1∶1000)、phosphate-4E-BP1(1∶1000)、phosphate-S6(1∶1000) 、Actin(1∶5000)，4℃摇床震荡过夜后洗涤并加入羊抗兔二抗(1∶5000)，室温孵育30 min，Assay buffer洗涤后，CSPD系统检测后转入暗室，将X线胶片压在膜上于不同时间曝光，自动洗片机洗片成像。实验中选取Actin作为内参照。

　　1.3.2 细胞计数 取生长分裂期MKN-45细胞，胰酶消化后置于24孔板内，每孔约1×104个细胞，体积1 ml，24 h细胞附壁后，根据分组加入相应干预药物，每孔最终体积1.5 ml，分别于用药后24、48、72 h用细胞计数仪进行细胞计数。实验重复3次。

　　1.3.3 细胞周期检测 取生长分裂期MKN-45细胞，胰酶消化后置于6孔板内，每孔约1×105个细胞，体积5 ml， 24 h细胞附壁后移去上清，根据分组加入相应干预药物，每孔最终体积5 ml，24 h后收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。

　　1.4 统计学处理 应用Stata 10.0进行数据处理，细胞计数及细胞周期数据采用单因素方差分析及两两比较进行差异分析。检验水准：α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 Western-blot检测结果 RAD001作用MKN-45细胞24 h，p70S6K、4E-BP1、S6无明显变化，phosphate-p70S6K、phosphate - S6表达缺失，phosphate 4E-BP1表达下降。见图1。图1 RAD001作用MKN-45细胞24 h后Western-blot检测蛋白结果

　　1. 阴性对照组;2.DMSO对照组;3.RAD组

　　2.2 细胞生长情况 RAD001作用24 h即开始出现对MKN-45细胞生长的抑制作用，随着作用时间延长至48、72 h，抑制作用逐渐增强，72 h时RAD组抑制率为40.11%，与阴性对照组、DMSO对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组与DMSO对照组之间无差异。见表1。

　　2.3 细胞周期的改变 RAD001作用24 h，MKN-45细胞细胞周期发生改变，停滞在G0-G1期细胞比例增加，RAD组G0-G1期细胞比例与阴性对照组、DMSO对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),阴性对照组与DMSO对照组间无差异。见表2。表1 各组不同时点MKN-45细胞计数与RAD组比较：*P<0.05表2 各组MKN-45细胞细胞周期分布与RAD组比较：*P<0.05

　　3 讨 论

　　mTOR 基因位于人常染色体1p36. 2 上( Gene ID : 2475)，编码全长2 549个氨基酸的mTOR 蛋白(相对分子质量289×103) ，mTOR被认为是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK)蛋白质家族成员。在mTOR激酶中存在FAT、FRB、FATC结构域，FATC/FAT以相互结合的形式在分子内协同作用调节mTOR激酶活性。FRB是FKBP-rapamycin 复合物结合区，在雷帕霉素特异性抑制mTOR的过程中起着连接作用[1，4]，雷帕霉素与其细胞内的受体FKBP12(FK506结合蛋白)结合，形成FKBP-rapamycin复合物，再与mTOR的FRB相结合，从而抑制mTOR激酶活性[5]。雷帕霉素是早期研究出的mTOR特异抑制剂，RAD001为雷帕霉素类似物，同样可以与mTOR的FKBP12蛋白结合位点结合形成复合物后发挥抑制作用。本实验体外给予药物后发现RAD001可抑制MKN-45细胞生长，抑制作用具有时间依赖性。

　　至于其作用机制，激活后的mTOR通过调节2条不同的下游通路(4E-BP1，p70S6K)来促进细胞周期转换，促进细胞增殖。在酵母中，雷帕霉素处理或TOR1、TOR2基因的失活都可导致细胞停滞在G 1期，因为TOR失活引起部分细胞周期蛋白合成的不足从而改变细胞周期分布，抑制细胞增殖[5] 。4E-BP1和p70S6K是最广泛研究的mTOR的底物，它们是蛋白翻译的关键因子。4E-BP1是一个低分子蛋白质，通过和eIF-4E的mRNA帽结合亚单位的结合抑制翻译起始。4E-BP1和eIF-4E的结合依赖于4E-BP1的磷酸化状态，在一般状态下主要是去磷酸化的状态。当有生长因子激活时，4E-BP1被mTOR磷酸化，降低了和eIF-4E的结合亲和能力，使eIF-4E能与eIF-4G/-4B/-4A结合形成多亚单位的eIF-4F复合物，从而导致蛋白质翻译的起始[6]。p70S6K是核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶，mTOR可使p70S6K的第412位苏氨酸残基磷酸化，p70S6K又使核糖体40S 小亚基S6蛋白磷酸化，从而使40S小亚基参与活跃的多糖核糖体翻译，对含5′末端寡聚嘧啶的mRNA的翻译起始起上调作用[7]。

　　本实验结果显示RAD001作用MKN-45细胞24 h后，p70S6K、4E-BP1、S6无明显变化，phosphate-p70S6K、phosphate - S6表达缺失，phosphate 4E-BP1表达下降;流式细胞仪检测细胞周期结果显示RAD001作用后MKN-45细胞细胞周期发生改变，停滞在G0-G1期细胞比例增加。因而提示RAD001通过抑制mTOR所调节的下游4E-BP1、p70S6K-S6通路，使MKN-45细胞停滞在G0-G1期比例增加，从而阻滞肿瘤细胞从G1期向S期的进程，发挥其抑制MKN-45细胞生长的作用。

　　在胃癌细胞的分裂与生长过程中，mTOR途径也扮演着重要角色。mTOR过度活化后加可快细胞周期的调控，影响肿瘤的进展及对化疗药物的敏感性。而这个过程却可以被mTOR 特异性抑制剂所抑制。因而，结合本实验结果，我们认为，进一步研究mTOR通路可为使用RAD001治疗胃癌提供更多的理论依据，对于mTOR 特异性抑制剂RAD001在胃癌中的研究将具有广阔的前景。

　　【参考文献】

　　[1] Fingar DC, Blenis J. Target of rapamycin (TOR): an integrator of nutrient and growth factor signals and coordinator of cell growth and cell cycle progression[J]. Oncogene，2004, 23 (18):3151-3171.

　　[2] Huang S, Houghton PJ. Targeting mTOR signaling for cancer therapy[J]. Curr Opin Pharmacol, 2003, 3(4):371-377.

　　[3] Baldo P, Cecco S, Giacomin E,et al. mTOR pathway and mTOR inhibitors as agents for cancer therapy[J]. Curr Cancer Drug Targets,2008,8(8):647-665.

　　[4] Asnaghi L, Bruno P, Priulla M, et al. mTOR: a protein kinase switching between life and death[J]. Pharmacol Res, 2004, 50 (6):545-549.

　　[5] Jacinto E, Hall MN. Tor signalling in bugs, brain and brawn[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003,4(2):117-126.

　　[6] Gingras AC, Raught B, Sonenberg N. Regulation of translation initiation by FRAP/mTOR[J]. Genes Dev, 2001, 15(7):807-826.

　　[7] Martin KA, Blenis J. Coordinate regulation of translation by the PI 3-kinase and mTOR pathways[J]. Adv Cancer Res, 2002, 86:1-39.