复灌时参附注射液处理可减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤

　　【摘要】 目的 观察复灌时参附注射液处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响。方法 利用大鼠Langendorff离体心脏灌流模型，制备心肌缺血再灌注损伤模型，在心脏缺血后再灌注同时给予参附注射液，观察大鼠心脏左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)和心率(HR),以及心肌组织中的ATP含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、冠脉流出液中肌酸激酶(CK)含量的变化。实验分为4组：正常对照组、单纯缺血/再灌注组、参附注射液30 ml/L组和60 ml/L组。结果 缺血/再灌注组大鼠心肌ATP含量和SOD活性明显降低，MDA和CK含量明显升高。与缺血/再灌注组比较，参附注射液60 ml/L组心肌MDA值减少，SOD值升高，ATP含量增加，冠脉流出液CK含量减少;血流动力学指标明显改善。结论 复灌时参附注射液处理可提高心肌组织ATP含量和SOD活性，减少MDA生成，减少CK含量，保护缺血/再灌注后的大鼠心脏。

　　【关键词】 参附注射液;心肌;缺血再灌注

　　Simultaneous Shenfu injection treatment during reperfusion mitigates ischemia/reperfusion myocardium injury in isolated rat hearts

　　XU Pengcheng, FENG Haorong, DAI Tijun

　　1. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Anesthesiology, Xuzhou, Jiangsu 221002, China; 2. Department of Anesthesiology, 98th Hospital of PLA, Huzhou, Zhejiang 313000;3. Department of Anesthetic Pharmacology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221004

　　Abstract: Objective To investigate the effect of simultaneous treatment with Shenfu injection (SF) during reperfusion on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats. Methods The myocardial ischemia/reperfusion model was prepared based on the Langendorff model for the perfusion of isolated rat heart. Following ischemia, reperfusion was allowed with SF injection administered simultaneously. The hemodynamic variables, such as left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), left ventricular developed pressure (LVDP), rate of left ventricular pressure development/relaxation (±dp/dtmax) and heart rate (HR), and the content of adenosine triphosphate (ATP), malendialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) in myocardial tissue and the activities of creatine kinase (CK) in coronary effluent fluid were observed. The isolated perfused rat hearts were separated into control, ischemia/reperfusion, SF 30 ml/L and SF 60 ml/L groups. Results In the ischemia/reperfusion group, the content of ATP and activity of SOD significantly decreased; the activities of MDA and CK significantly increased. SF 60 ml/L attenuated the decrease of SOD and the increase of MDA and CK compared with the ischemia/reperfusion group. SF 60 ml/L significantly improved the recovery of the hemodynamic variables and myocardial ATP concentrations following ischemia and reperfusion. Conclusion Simultaneous SF treatment during reperfusion could provide the cardiac protection effect against the ischemia/reperfusion injury by increasing the content of ATP and activity of SOD and decreasing the activity of MDA and CK in myocardial.

　　Key words: Shenfu injection; myocardium; ischemia/reperfusion

　　参附注射液是一种中药针剂,由红参和黑附片提取物组成, 主要有效成分为人参皂苷和乌头碱,目前临床已广泛用来治疗心绞痛、心肌梗死、心力衰竭等疾患，也被用于体外循环心脏瓣膜置换术[1-3]。近年来，实验已证实在缺血前应用参附注射液对缺血/ 再灌注损伤心肌有保护作用[4-5]。但复灌时应用参附注射液对心肌缺血/再灌注损伤的作用如何尚不十分清楚，本实验采用Langendorff 大鼠离体心脏灌流模型, 观察复灌后应用参附注射液对离体大鼠心脏缺血/再灌注后血流动力学以及组织中的高能磷酸化合物ATP含量的影响，为临床治疗用药提供实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　健康雄性SD 大鼠,体重250～280 g,由徐州医学院实验动物中心提供。

　　1.2 药物与试剂

　　参附注射液(主要成分为人参皂甙和乌头碱,浓度分别为0.8 g/L和0.1 g/L,批号070703) 由雅安三九药业有限公司提供。ATP购自Sigma公司，硫酸氰四丁胺(TBAHS)购自Aldrich公司，考马斯亮蓝G-250、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肌酸激酶(CK)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。其他试剂均为国产分析纯。

　　1.3 实验分组及步骤

　　大鼠戊巴比妥钠(45 mg/kg) 腹腔注射麻醉,开胸取心,用冷灌流液冲掉残留血液,并迅速移到Langendorff 灌流装置上,灌流液为Krebs - Hanseleit 磷酸缓冲液,灌流压为88 kPa。灌流前用95%氧气和5%二氧化碳混合气体向灌流液中平衡20 min。32只大鼠随机分为4组,每组均为8 只。正常对照组(C组):大鼠心脏离体后接在灌流装置上持续灌流110 min。单纯缺氧/复氧组(I/R组):大鼠心脏离体后接在灌流装置上先预灌20 min,然后停止灌流,再恢复灌流60 min。参附注射液30 ml/L组和60 ml/L组(SF30 组，SF60 组):分别在再灌注后加入参附注射液,其他处理同单纯缺血/再灌注组。实验时参附注射液溶解于灌流液中,稀释的体积分数为3.0%和6.0%，即30 ml/L和60 ml/L。灌注结束时,取心脏左室心肌组织制成10%组织匀浆，用于心肌组织ATP含量、MDA活性和SOD含量等测定。

　　1.4 血流动力学指标测定

　　左心耳处剪一小口，将带有小乳胶水囊的测压管经二尖瓣口插入左心室，连接压力换能器，经MP-100A-CE模数转换器(BIOPAC System, Inc, USA)与计算机相连。调节左室舒张末压为2～4 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。Acqknowledge 4.0软件实时采集和记录左室舒张末压(LVEDP)，并计算和显示左室发展压(LVDP)、左室内压上升/下降最大速率(±dp/dtmax)和心率(HR)等。用秒表计数每分钟经冠脉流出的液体量(冠脉流量，CF,ml/min)。

　　1.5 ATP测定的色谱条件

　　流动相为215 mmol/L KH2PO4、2.3 mmol/L TBAHS与3.5 %乙腈组成,pH为6.25。流速为0.9 ml/min。紫外检测器,波长为210 nm。

　　1.6 心肌组织MDA活性和SOD含量的检测

　　取10%心肌组织匀浆液，用硫代巴比妥法(TBA) 测定MDA 含量，用羟胺法测定SOD 活力。用考马斯亮蓝G-250 测定心肌组织蛋白质的含量。操作步骤按试剂盒说明书进行。

　　1.7 冠脉流出液CK含量的检测

　　再灌注60 min时收集冠脉流出液，用分光光度计测量流出液中CK的活性(按试剂盒说明书操作)。

　　1.8 统计学处理

　　所有数据均用Prism 3.0统计软件进行处理,数据用±s表示。多组间比较应用单因素方差分析法进行分析,两两比较应用One-way ANOVA的Newman-Keuls法进行q检验。检验水准：α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 参附注射液对缺血/再灌注大鼠心脏血流动力学的影响

　　平衡灌注后(缺血前)，各血流动力学指标均无显著性差异。用含有参附注射液的灌注液复灌后，SF30组的各血流动力学指标和恢复率与I/R组比较也无显著性差异(P>0.05);而SF60组LVEDP、LVDP、+dp/dt和CF均有明显改善(54±15，51±10，1035±240和11.8±2.3 vs. 72±11,35±8,720±206和8.8±1.9)，它们的恢复率与I/R组比较也存在显著性差异(862±365,47±9,49±8和77.6±13 vs. 2400±390,33±7,36±9和59±11)(P<0.05);SF60组HR的恢复率虽有改善趋势，但无显著性(P>0.05)。

　　2.2 参附注射液对缺血/再灌注大鼠心肌SOD活性和MDA生成以及冠脉流出液CK含量的影响

　　与正常对照组比较，缺血/再灌注使各组心肌SOD活性下降，MDA含量升高，冠脉流出液CK含量增加。与I/R组比较，SF30组的SOD活性、MDA和CK含量无显著差异(P>0.05);SF60组SOD活性显著升高，MDA和CK含量显著下降(P<0.05)(表1)。

　　2.3 参附注射液对缺血/再灌注大鼠心肌ATP含量的影响

　　如表2所示，平衡灌注后(缺血前)，各组心肌ATP含量无显著性差异。缺血/再灌注后，I/R组心肌ATP含量明显低下。与I/R组比较SF30组的心肌ATP含量有所升高，但无显著性差异(P>0.05);SF60组心肌ATP含量则明显升高(P<0.05)。表1 各组大鼠心肌MDA、SOD和冠脉流出液CK活性

　　的变化(略)表2 参附注射液对缺血/再灌注大鼠心肌ATP含量

　　的影响(略)

　　3 讨 论

　　预先应用参附注射液无论是在体还是离体实验都显示有抗心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[4-6]。本实验结果显示，复灌时给予较大剂量(体积分数为6.0%)的参附注射液处理也能改善缺血/再灌注后心脏血流动力学的恢复，提高心肌组织的SOD活性，减少MDA生成量;增加复灌后心肌ATP的含量。

　　心肌缺血/再灌注损伤发生机制尚未完全阐明,目前认为主要与缺血/再灌注时细胞内Ca2+超载、自由基的产生及其介导的脂质过氧化反应以及高能磷酸化合物缺乏有关[7-8]。因此,有效增加氧自由基清除能力及降低细胞内Ca2+超载,恢复缺血心肌细胞合成能量功能,是抗心肌缺血/再灌注损伤的重要措施。

　　参附注射液是红参和附子的提取物,其主要有效成分是人参皂甙和乌头类生物碱。复灌时应用参附注射液后，其中的人参皂甙能提供能量基质,增加底物水平磷酸化,促进三磷酸腺苷磷酸肌酸合成,保护心肌细胞线粒体Ca2+泵活性,减少线粒体膜磷脂降解,保护膜系统完整，并能降低细胞内游离Ca2+浓度,进而减轻细胞内钙负荷超载[9-10]。而附子[11-13]的主要成分甲乌药碱及非生物碱部分可以通过对心脏的直接和间接作用，增加缺血心肌灌流和供氧供能。还可以通过其糖皮质激素样作用，产生抗炎、抗凝、抑制血小板聚集和活化的作用，从而降低血液黏滞度,改善缺血心肌组织微循环，增加冠脉流量。这些可能就是复灌时应用参附注射液对抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制。复灌时应用参附注射液降低脂质过氧化反应，增加自由基清除能力的机制仍需进一步研究。

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