TRAIL联合PDTC对SGC-7901细胞生长抑制和凋亡诱导的实验研究

　　【摘要】 目的 观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及TRAIL联合核转录因子核因子-κB(NF-κB)活性特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制和凋亡诱导作用，并寻找逆转TRAIL耐药的方法。方法 采用不同浓度的TRAIL及TRAIL联合PDTC作用于胃癌细胞后，MTT法检测细胞生长抑制率，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，免疫细胞化学染色方法观察药物作用前后NF-κB表达情况。结果 单独使用TRAIL时，随着浓度从50 μg/L增加到500 μg/L，细胞的生长抑制率和凋亡率逐渐增加(P<0.05),但这种作用是非线性的。TRAIL联合0.05 μmol/L、0.1 μmol/L PDTC后肿瘤细胞的生长抑制率和凋亡率较单用TRAIL显著下降(P<0.05);而联合1 μmol/L、10 μmol/L PDTC后其作用较上有所上升(P<0.05)。联合作用组 p65蛋白在胞核中染色的强度低于单纯使用TRAIL组(P<0.05)。结论 TRAIL对胃癌细胞株SGC-7901具有一定程度的生长抑制和凋亡诱导作用;NF-κB信号转导途径可能具有双向调节作用，大剂量PDTC可能逆转胃癌细胞对TRAIL的耐药。

　　【关键词】 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;吡咯烷二硫代氨基甲酸盐;胃癌细胞;凋亡;核因子-κB

　　An experimental study of the effect of TRAIL combined with PDTC on the growth inhibition and apoptosis induction of SGC-7901 gastric cancer cells

　　LIU Ling， FEI Sujuan

　　Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China

　　Abstract：Objective To observe the effect of a combination of pyrrolidine dithiocarbonate (PDTC), a specific inhibitor of NF-κB and tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on the apoptosis of gastric cancer cells and their effect on the expression of NF-κB, and to search for the approaches to reversing resistance to TRAIL in human stomach cancer cells. Methods Various concentrations of TRAIL and PDTC were added in exponential growth SGC-7901 gastric cancer cells. MTT assays were used to measure the growth inhibitory effect of combined use of TRAIL and PDTC or alone. Apoptosis of gastric cancer cell SGC-7901 was analyzed with PI staining method and flow cytometry (FCM). The expression of NF-κB was observed using immunohistochemical staining method. Results After the SGC-7901 gastric cancer cells were exposed to TRAIL at a dose of 50 μg/L to 500 μg/L, the growth inhibitory rate and apoptosis rate increased (P< 0.05), but there was no linearity for this dose-effect relationship. Following TRAIL treatment in combination with 0.05 μmol/L and 0.1 μmol/L PDTC, the growth inhibitory rate of and apoptosis rate significantly decreased compared with treatment with TRAIL or PDTC alone (P<0.05), while following TRAIL treatment in combination with PDTC 1 μmol/L and 10 μmol/L, the growth inhibitory rate and apoptosis rates increased compared with treatment with TRAIL or PDTC alone (P<0.05). The two drugs presented synergistic or added effect on SGC-7901 cells. The expression of NF-κB decreased subsequent to the treatment of PDTC(P< 0.05). Conclusion TRAIL has the effect of growth inhibition and apoptosis induction on SGC-7901 gastric cells to some degree. The NF-κB signal pathway might have a bidirectional effect in apoptosis regulation, and large dose of PDTC could reduce the resistance of TRAIL in SGC-7901 gastric cells.

　　Key words: tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; pyrrolidine dithiocarbonate; gastric cancer; apoptosis; nuclear transcript factor-κB

　　肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand , TRAIL) 是肿瘤坏死因子家族的成员之一 ,又名Apo2L[1 ]。TRAIL共有5种受体[2]：死亡受体DR4、DR5，诱骗受体DcR1、DcR2，一种调节骨密度的受体(OPG)。核因子-κB(NF-κB)是一种重要的核转录因子 ,参与炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等多种生理和病理过程。研究表明 ,NF-κ B 在肿瘤的抗凋亡机制中起关键性作用 ,抑制肿瘤细胞 NF-κB的活性将引起肿瘤细胞凋亡 ,从而抑制肿瘤细胞的生长[3]。细胞凋亡的抑制与恶性肿瘤的发生发展以及化疗不敏感有密切关系 ,因此研究胃癌细胞对TRAIL敏感性与NF-κB表达的关系 ,对揭示胃癌细胞对TRAIL的耐药机制可能有重要作用。为此,本研究观察了TRAIL及TRAIL联合NF-κB活性特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对胃癌细胞株SGC-7901细胞的生长抑制和凋亡诱导,并分析了胃癌细胞对 TRAIL的不同敏感性与NF- κB表达的关系，以期寻找逆转其耐药的方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　SGC-7901胃癌细胞引自中国人民解放军第九七医院肿瘤实验室,TRAIL蛋白购自Peprotech公司，PDTC购自Sigma公司, MTT购自 Duchefa公司,二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司,碘化丙啶(PI) 购自Sigma公司,RNA酶购自Faizyme公司,鼠抗人NF-κB p65单克隆抗体购自Santa Cruz公司,PV-6002 二步法检测试剂盒和DAB显色液购自北京中杉金桥生物有限公司,SEAC全自动酶免系列分析仪购自北京希亚克技术有限公司,流式细胞仪(FCM)购自美国BD公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT法检测肿瘤细胞的生长抑制率

　　1.2.1.1 TRAIL对胃癌细胞株SGC-7901的细胞毒作用

　　细胞以每孔200 μl (2×105个/ml)接种于96孔板，培养24 h后，分别加入TRAIL，使其最终浓度达到0、50、100、200、500 μg/L,每组复设6孔，同时设立不接种细胞的空白对照组。作用48 h后,每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl,继续培养 4 h,弃上清,每孔加入150 μl DMSO,振荡10 h后,酶标仪波长540 nm测其光密度(D)。抑制率=〔1-(D实验组-D空白对照组)/(DTRAIL0-D空白对照组)〕×100%。实验重复3次,取其平均值。

　　1.2.1.2 应用PDTC后TRAIL对胃癌细胞株SGC-7901的细胞毒作用

　　根据所加药物的不同实验分为3组：空白对照组、PDTC组、TRAIL+PDTC组。PDTC组：PDTC按0、0.05、0.1、1、10、50、100 μmol/L给予。TRAIL+PDTC组:PDTC浓度分别取0、0.05、0.1、1、10、100 μmol/L，PDTC每一浓度均分别与TRAIL的浓度0、50、100、200、500 μg/L进行组合，共计30组。实验步骤及抑制率计算同上。

　　1.2.2 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。

　　1.2.2.1 应用TRAIL后胃癌细胞的凋亡

　　细胞以每孔2×105个/ml接种于24孔板中，分别加入0、50、100、200、500 μg/L TRAIL，每组设3个复孔。按试剂盒说明书操作，用FCM检测,记录激发波长488 nm处的红色荧光。

　　1.2.2.2 应用PDTC后细胞的凋亡

　　根据所加药物的不同实验分为3组,依次为空白对照组、PDTC组、TRAIL+PDTC组。PDTC组：PDTC按0、0.1、10 μmol/L给予。TRAIL+PDTC组:PDTC浓度分别取0、0.1、10 μmol/L，每一浓度均分别与TRAIL的浓度0、50、100、200、500 μg/L进行组合。实验步骤同上。

　　1.2.3 免疫细胞化学染色检测NF-κB p65蛋白在SGC-7901胃癌细胞中的表达

　　1.2.3.1 TRAIL作用后NF-κB p65蛋白在SGC-7901胃癌细胞中的表达

　　细胞培养后制成细胞密度为1×104/ml的细胞悬液，每孔1 ml接种于24孔培养板中，24 h后换液，分别加入对照液(培养液)、TRAIL(50、100、200、500 μg/L)，继续培养1 h，取出细胞爬片，严格按照PV-6002二步法检测试剂盒说明书进行操作。

　　1.2.3.2 PDTC作用后NF-κB p65蛋白在SGC-7901胃癌细胞中的表达

　　对照组、200 μg/L TRAIL+PDTC 0.1 μmol/L组、200 μg/L TRAIL+ PDTC 10 μmol/L组进行免疫细胞化学染色检测。实验步骤同上。

　　1.3 统计学处理

　　用SPSS 13.0软件包进行数据处理，计量资料采用±s表示，多组均数两两比较采用SNK检验, P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 胃癌细胞生长抑制率

　　2.1.1 TRAIL对胃癌细胞生长的影响

　　TRAIL可抑制SGC-7901胃癌细胞增殖,并随药物浓度增加，细胞杀伤作用也有缓慢提升。100、200、500 μg/L组较对照组有统计意义。但当TRAIL浓度大于200 μg/L时，随浓度增加，细胞抑制率增加不明显。见图1。

　　2.1.2 TRAIL与PDTC合用对胃癌细胞生长的影响

　　MTT结果显示单独使用PDTC时，随着浓度的增加，细胞的生长抑制率也增加,不同浓度组进行比较,差异有统计学意义(P<0.05)。联合使用TRAIL和PDTC,当PDTC浓度较低(0.05、0.1 μmol/L)时，两药显示拮抗作用，当PDTC浓度>1 μmol/L时，两药显示相加或协同作用。见表1。表1 不同浓度TRAIL和PDTC单用及联合应用对SGC-7901细胞生长抑制作用的比较(略)

　　2.2 胃癌细胞凋亡率

　　2.2.1 TRAIL对胃癌细胞凋亡的影响

　　TRAIL对胃癌细胞具有凋亡诱导作用，随着TRAIL浓度的增高，细胞的凋亡率也增加。见图2。

　　2.2.2 TRAIL与PDTC合用对胃癌细胞凋亡的影响

　　结果与MTT结果相似。单用PDTC时，随着药物浓度的增加，细胞的凋亡率也増加，组间差异有统计学意义(P<0.05)。PDTC浓度为0.1 μmol/L时，两药合用后凋亡率下降，显示拮抗作用;PDTC浓度为10 μmol/L时，两药合用后凋亡率上升，显示相加或协同作用。见表2、图3。表2 不同浓度TRAIL和PDTC单用及联合应用对SGC-7901细胞凋亡作用的比较(略)

　　2.3.1 TRAIL对SGC-7901细胞NF-κB表达的影响

　　正常培养条件下，NF-κB p65蛋白主要存在于细胞的胞质中，胞核呈阴性或弱阳性着色。TRAIL作用1 h后可看到p65蛋白在胞核中阳性染色的细胞数增加，且在胞核中的染色加深，而在胞质中的染色则变浅，提示TRAIL能诱导NF-κB p65蛋白向细胞核转移。见图4。

　　2.3.2 TRAIL联合PDTC对SGC-7901细胞NF-κB表达的影响

　　应用PDCT预处理30 min后，TRAIL诱导的NF-κB p65蛋白核转位效应被明显抑制，TRAIL联合PDTC组p65蛋白在胞核中染色的强度低于单纯使用TRAIL组。见图5。

　　3 讨 论

　　TRAIL可选择性地诱导肿瘤细胞发生凋亡 ,而对正常细胞无明显细胞毒性。从实验中我们观察到TRAIL对胃癌细胞株SGC-7901具有一定程度的生长抑制和凋亡诱导作用，且这种作用呈剂量依赖性。但这种量效关系并非线性关系，TRAIL浓度>20 μg/L后，尤其是抑制率增加不明显，当TRAIL浓度达到500 μg/L的较高浓度时,肿瘤细胞的抑制率和凋亡率也不超过30%,提示胃癌细胞对TRAIL具有一定的耐药性。

　　NF-κB是一种分布和作用都很广泛的核转录因子 ,多种细胞因子都可以引起NF-κB活化，其通常以 p65/p50异二聚体的形式存在 ,也是其主要活性形式[4]。研究发现NF-κB在多种恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤和多数实体肿瘤中发挥关键作用[5]。因此抑制NF-κB活化可望成为肿瘤治疗的一个途径[6]。

　　PDCT是NF-κB特异性的抑制剂,主要通过抑制NF-κB p65亚单位,或抑制 IκB的降解,减少NF-κB 的核移位来抑制NF-κB的活性[7]。有研究报道，抑制NF-κB活性后,可诱导抗凋亡基因 Livin表达下调,促进肿瘤细胞的凋亡[8]。本研究发现，小剂量PDTC和TRAIL联用后可抑制TRAIL的抗肿瘤作用，表现为细胞的抑制率和凋亡率明显下降，而大剂量的PDTC和TRAIL联用后，细胞的抑制率和凋亡率则明显上升，推测大剂量PDTC可能逆转了胃癌细胞对TRAIL的耐药。这进一步证实了NF-κB的双向调节性。

　　结合本研究结果和相关研究报道, 我们认为NF-κB有可能成为诱导肿瘤细胞凋亡的分子靶点。通过多种途径调控NF-κB的活性,诱导肿瘤细胞发生凋亡,有可能成为目前肿瘤治疗中的一个较有前景的研究方向,为肿瘤的临床治疗探索一条新的途径。

　　【参考文献】

　　[1]Pitti RM, Marsters SA, Ruppert S, et al. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand , a new member of the tumor necrosis factor cytokine family [J]. J Biol Chem, 1996, 271 (22):12687-12690.

　　[2]Kimberley FC, Screaton GR. Following a TRAIL: update on a ligand and its five receptors[J]. Cell Res,2004, 14(5):359-372.

　　[3]Biswas DK, Martin KJ , McAlister C , et al. Apoptosis caused by chemotherapeutic inhibition of nuclear factor-κB activation [J]. Cancer Res,2003, 63(2):290-295.

　　[4]Aggarwal BB,Takada Y,Shishodia S,et al.Nuclear tranocription factor NF-kappa B:role in biology and medicine [J].Indian J Exp Biol,2004,42(4):341-353.

　　[5]Zerbini LF,Wang Y,Gzibere A,et al.NF-κB-mediated repression of grouth arrest-and DNA-damage-inducible proteins 45 α and γ is essential for cancer cell survival [J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(37):13618-13623.

　　[6]Lu T,Burdelya LG,Swiatkowaski SM.Secreted transforming growth factor beta2 activates NF-κB,blocks apoptosis and is essential for the survival of some tumor cells [J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(18):7112-7117.

　　[7]Bruck R, Schey R, Aeed H, et al. A protective effect of pyrrolidine dithiocarbamate in a rat model of liver cirrhosis[J].Liver Int,2004,24(2):169-176.

　　[8]朱华云,刘凌翔 ,葛红梅,等. NF-κB抑制剂PDTC 对人胃癌SGC-7901 细胞凋亡及 Livin和Caspase-3表达的影响[J]. 南京医科大学学报:自然科学版,2007,27(8):816-820.