PDZ1/2结构域与腺病毒穿梭载体重组体的构建

　　【摘要】 　　目的 构建 PSD-95结构域PDZ1/2腺病毒重组体。方法 以异硫酸氰胍-酚-氯仿一步法提取的总RNA为模板，采用RT-PCR法获得PDZ1/2的cDNA;与腺病毒穿梭载体用T4 DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果 ① 经RT-PCR得到了PDZ1/2的cDNA;②酶切鉴定能观察到PDZ1/2和pAdTrack-CMV两条带;③ PDZ1/2测序图谱与文献报道完全一致。 结论 成功构建了含目的基因PDZ1/2的腺病毒穿梭载体重组体。

　　【关键词】 PDZ1/2;RT-PCR;腺病毒穿梭载体;序列测定

　　Construction of recombinant pAdTrack-CMV-PDZ1/2

　　GAO Fang, HU Shuqun, SUN Dong, ZHANG Guangyi

　　(1. Department of Anesthesiology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China; 2. Research Center of Biochemistry and Molecular Biology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract： Objective To construct recombinant pAdTrack-CMV-PDZ1/2. Methods The total RNA extracted with single-step method by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction was used as the template, and the cDNA of PDZ1/2 domain was amplified by RT-PCR; the former was subsequently cloned into the shuttle vector pAdTrack-CMV (CLONTECH) by ligation of T4 DNA ligase. Thereafter, the sequence was transfected into E. coli Electro-Cell JM109 for screening and determination.Results ① The cDNA of PDZ1/2 was amplified by RT-PCR. ② The recombinant contained two bands of pAdTrack-CMV and PDZ1/2 by restriction enzyme digestion. ③ The sequence chromatogram of cloned PDZ1/2 was in accordance with GenBank Database. Conclusion Recombinant of the targeted pAdTrack-CMV-PDZ1/2 is successfully constructed.

　　Key words: PDZ1/2; RT-PCR; pAdTrack-CMV; sequence determination

　　目前，关于缺血性脑卒中神经元损伤和死亡的分子机制主要有3种假说：谷氨酸兴奋毒性、钙超载和自由基。其中，谷氨酸过度激活其受体是缺血性脑卒中脑损伤的关键。

　　谷氨酸受体(GluR)有离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体[1]。天门冬氨酸受体(NMDAR)和海人藻酸受体(KAR)是离子型谷氨酸受体的重要成员。GluR6是海人藻酸受体的重要组成部分。基于我们以前的研究和实验结果[2-4]，我们提出一个新的缺血性脑卒中神经元凋亡的信号通路：谷氨酸→GluR6→PSD-95→MLK→MKK7→JNKs→核依赖的/非核依赖的通路→Caspase 3。

　　此通路中PSD-95蛋白(postsynaptic density-95)是NMDAR、KAR信号复合体的主要成员。PSD-95家族是膜结合鸟苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinase，MAGUK)家族的亚家族。PSD-95家族的结构特征是：氨基端3个PDZ(PSD-95/Dlg/Z0-1)结构域，1个SH3(Src homology 3)结构域和羧基端无活性的鸟苷酸激酶(GK)结构域。这些结构域可分别介导PSD-95家族蛋白质与特异性蛋白质的相互作用[5-7]。如PDZ1/2结构域介导PSD-95与NMDAR2B和GluR6 受体相互作用。

　　为了证实过表达PDZ1/2能否抑制NMDAR2B和GluR6与PSD-95的结合，本研究以大鼠海马为原料提取总RNA，通过RT-PCR得到其双链cDNA，经酶切回收后，用T4 DNA连接酶将DNA连接到腺病毒穿梭载体上，测序后筛选得到没有发生突变的PDZ1/2腺病毒重组体。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂

　　酚：氯仿：异戊醇(phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1)、氨苄青霉素(ampicillin)、矿物油(mineral oil)、低熔点琼脂糖(LMP agarose)为Sigma公司产品。dNTPs、质粒制备试剂盒、T4DNA连接酶、Access RT-PCR system、Total RNA isolation system及限制性内切酶HindⅢ、BglⅡ为Promega公司产品。pAdTrack-CMV为CLONTECH公司产品。1 kb DNA ladder、琼脂粉、LB培养基为Gibco BRL(Grand Island，NY，USA)公司产品。琼脂糖为Bio-Rad公司产品。引物由Gibco BRL公司合成。其他常用试剂均为国产分析纯。

　　1.2 实验动物

　　SD大鼠由徐州医学院实验动物中心提供，清洁度Ⅱ级，自由饮食，室温12℃ 12 h昼夜节律下饲养。

　　1.3 菌株

　　大肠杆菌菌株JM109由本室保存。

　　1.4 PDZ1/2 cDNA的克隆

　　1.4.1 大鼠海马的剥离

　　取SD大鼠断头处死,开颅后迅速取出海马组织。

　　1.4.2 总RNA的提取

　　将上述海马转移至匀浆器内，加入1 ml变性液。然后于冰浴中充分匀浆。匀浆液中加入0.1 ml 2 mol/L醋酸钠(pH 4.0)、1 ml酚、196 μl氯仿、4 μl异戊醇，混匀20 s后，置冰浴15 min，转移至EP管中，于4℃ 10 000 g离心20 min，转移水相至新EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜沉淀。次日，于4℃10 000 g离心20 min，加入0.3 ml变性液重新悬浮,然后加等体积异丙醇于-20℃沉淀1 h。4℃ 10 000 g离心20 min，沉淀以75%乙醇重新悬浮,4℃ 10 000 g离心20 min,沉淀于室温干燥后加入50 μl DEPC处理过的水溶解。

　　1.4.3 反转录PCR(RT-PCR)

　　RT-PCR上游引物为5′ -AGGCCCAGATCTATGGACTGTCTCTGTAT-3′，下游引物为5′-CTCATTAAGCTTTTACTGAGAATACGAGGTT-3′。浓度为10 μmol/L。

　　取一0.6 ml离心管，按下列次序加入以下物质：

　　水 26 μl

　　10×反应缓冲液5 μl

　　dNTPs5 μl

　　上游引物5 μl

　　下游引物5 μl

　　反转录酶1 μl

　　Taq DNA聚合酶1 μl

　　RNA样品3 μl

　　总体积50 μl

　　混匀管内混合物，滴入20～40 μl矿物油覆盖表面。将上述反应管放入PCR仪，按下列参数进行循环:

　　48℃ 45 min 1 cycle

　　94℃ 2 min 1 cycle

　　94℃ 30 s

　　63℃ 1 min

　　68℃ 1 min 35 cycle

　　68℃ 7 min 1 cycle

　　反应完毕取出反应管，鉴定片段大小。

　　1.4.4 PDZ1/2 cDNA片段的回收

　　将所获RT-PCR产物经酚、氯仿纯化后，于37℃以内切酶BglⅡ、HindⅢ双酶切过夜。以低熔点琼脂糖法回收DNA片段，称取0.3 g低熔点琼脂糖，倒入含30 ml TBE缓冲液的锥形瓶内，于水浴中加热熔化。将制胶模具的两端用透明胶带封好，待熔化的琼脂糖冷却至50℃左右时，加入5 μl 溴乙锭(EB)，摇匀，倒入两端封好的制胶具中，并迅速插上梳子。4℃静置30 min后，拔出梳子，撕去模具两端透明胶带，将凝胶放置于电泳槽中。加入1×TBE缓冲液，让液面略高于胶面。取一片保鲜膜，吸取约2 μl上样缓冲液置于膜上。吸取7 μl样品与上样缓冲液混匀后，用移液枪将DNA样品小心加入样品孔中，4℃恒流80 mA电泳，紫外灯下观察目的条带移到适当位置时，关闭电源;将凝胶取出置于一干净玻璃板上，于长波紫外灯照射下将所需条带切下，装入1.5 ml离心管中，加入凝胶条5倍容积的20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1 mmol/L (pH 8.0)溶液，65℃水浴中加热5 min溶化凝胶，冷却到室温后加入等体积的0.1 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)饱和的酚，剧烈振荡混匀20 s，室温下4 000 g离心10 min，小心吸出上层水相，用等体积的酚/氯仿、氯仿各抽提1次，上层水相转移置一新的1.5 ml离心管中，加入0.1倍体积3 mol/L的醋酸钠,2.5倍体积的无水乙醇，混匀，13 000 g 4℃离心20 min，沉淀用乙醇漂洗1次，13 000 g 4℃离心20 min，室温干燥2 min，加入适当体积的TE溶解。pAdTrack-CMV穿梭载体酶切后处理同上。

　　1.4.5 PDZ1/2 cDNA与载体的连接和重组DNA的转化

　　向一个0.6 ml EP管中依次加入下列试剂：

　　H2O 6 μl

　　10×buffer1 μl

　　载体1 μl

　　cDNA1 μl

　　T4连接酶1 μl

　　总体积10 μl

　　混合后16℃或室温保温16 h。

　　取1 μl重组质粒或5 μl连接产物，加入150 μl预先制备的感受态细胞JM109，混匀。冰浴30 min。立即放入37℃水浴5 min。加入预热的2×YT培养基450 μl 37℃水浴1 h，取150 μl涂平板，使其均匀分布于平板表面，在37℃培养箱中倒置平板，培养过夜。次日观察有无菌落生长。

　　1.4.6 PDZ1/2重组体的鉴定

　　对于通过平板初步筛选鉴定具有重组子的菌落，进行小量(3～5 ml)培养后，制备质粒DNA，用相应的内切酶切割重组子，释放出插入的片段，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定其分子量。

　　1.4.7 PDZ1/2重组体的序列测定

　　将上述电泳鉴定正确的Ad-PDZ1-GFP 重组体进行测序鉴定。 PDZ1/2的序列由上海基康生物技术有限公司利用自动测序仪进行测定。

　　2 结果

　　2.1 RT-PCR

　　以大鼠海马总RNA为模板，进行RT-PCR，吸取7 μl PCR产物与2 μl上样缓冲液混匀后，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，可见一约804 bp的DNA片段(图1)。提示PDZ1/2被成功扩增。

　　2.2 重组质粒的鉴定

　　PCR产物与质粒pAdTrack-CMV经BglⅡ、HindⅢ双酶切并纯化后，在T4 DNA连接酶作用下室温连接4 h后转化感受态细胞JM109。小量制备所获的质粒经双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示2条DNA片段(图2)，一条与pAdTrack-CMV载体碱基数相符，另一条DNA片段(约804 bp)与PDZ1/2碱基数一致。证明PDZ1/2与pAdTrack-CMV形成重组体。

　　2.3 序列测定

　　全自动测序的结果中,所克隆的PDZ1/2序列与GeneBank报道的PSD-95的PDZ1/2序列完全一致。见图3。

　　3 讨论

　　多年来一直把缺血性脑卒中脑损伤的分子机制的研究重点集中在NR的研究上。虽然NR拮抗剂在实验型局灶脑缺血模型中有一定保护作用，但是其毒副作用很大，至今难以用于临床治疗[8-9]。所以，促使我们考虑采用其他手段阻断NR与胞内的信号传递。在瞬时全脑缺血模型上，对于阻断选择性海马CA1区神经元死亡，AMPA/KA受体拮抗剂比NR拮抗剂的作用效果更好[8]。本室已构建了TAT- GluR6羧基端小肽，证明能够阻断GluR6与PSD-95结合，从而抑制了GluR6 PSD-95 MLK3 JNK信号通路[10]。我们实验室在脑缺血研究中，发现并报道了MLK抑制剂SP600125和K252a都具有保护缺血性脑损伤作用[11-12]。但是，由于TAT- GluR6羧基端小肽在阻断GluR6与PSD-95结合的同时，也可能阻断GluR6下游其他的通路，影响正常的生理功能，而MLK抑制剂SP600125和K252a在给药中的不便，都促使我们考虑采用其他方法特异阻断GluR6 PSD-95 MLK3 JNK信号通路。

　　基于以上考虑，我们构建了PDZ1/2-腺病毒重组体。下一步将进行原核重组和真核包装，并将在大鼠海马神经元中过表达PDZ1/2，证实过表达PDZ1/2能否抑制NMDAR2B和GluR6与PSD-95的结合。

　　【参考文献】

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