左旋卡尼汀预处理对离体兔心缺血/再灌注致心肌损伤及MDA、SOD的影响

　　【摘要】 目的 观察左旋卡尼汀(L-CN)预处理对离体兔心缺血/再灌注致心肌损伤及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响。方法 采用离体兔心Langendorff灌注实验模型,离体兔心12只随机分成缺血/再灌注组(I/R组)和L-CN预处理组，每组6只。I/R组灌注K-H液25 min，(兔心)4℃标准St.Thomas停搏液(K+ 16 mmol/L)至心脏停搏,45 min后恢复K-H液灌注20 min; L-CN预处理组灌注K-H液10 min，再予L-CN续灌15 min，余步骤同I/R组。测定再灌注末心肌组织中MDA、SOD的活性; 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色测定心肌存活面积百分比。结果 L-CN预处理组SOD活性明显高于I/R组(P<0.01)，MDA含量明显低于I/R组(P<0.05)。L-CN预处理组心肌存活面积百分比高于I/R组(P<0.05)。结论 L-CN预处理对高钾停搏离体兔缺血/再灌注心脏具有抑制氧化应激、提高抗氧化能力的作用，可减轻心肌损伤。

　　【关键词】 缺血/再灌注损伤;离体心脏;左旋卡尼汀;预处理;家兔

　　Effect of L-carnitine preconditioning on superoxide dismutase and malondialdehyde levels against ischemia/reperfusion-induced myocardial injury in isolated rabbit hearts

　　ZHAO Ningjun, XU Tie, YE Ying, YAN Xianliang, LIANG Gaoyong, LIU Bei

　　Department of Emergency Care, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China

　　Abstract: Objective To investigate the effects of L-carnitine (L-CN) preconditioning on levels of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) against ischemia/reperfusion-induced myocardial injury in isolated rabbit hearts. Methods The experiment was performed on isolated rabbit hearts perfused on Langendorff apparatus. 12 rabbit hearts were randomized into ischemia/reperfusion group (I/R group) and L-CN preconditioning group (n=6 each). The I/R group was firstly perfused with Krebs-Henseleit buffer (K-H) solution at 4℃ for 25 min, followed by St. Thomas Ⅱ solutions (K+ 16 mmol/L) until cardiac arrest for 45 min and then reperfused with K-H solution for 20 min. The treatment of L-CN preconditioning group was similar to that of the I/R group, except that this group was initially perfused with K-H solution for 10 min and then perfused with L-CN. At the end of reperfusion, the contents of MDA, the activity of SOD were measured. The percentage of survival areas of myocardium was measured by using 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) stain. Results In contrast to the findings in the I/R group, the percentages of surviving myocardium areas in the L-CN preconditioning group were higher (P<0.05). SOD content in L-CN preconditioning group was significant higher than that in I/R group (P<0.01). MDA content in L-CN preconditioning group was significantly lower than that in I/R group (P<0.05). Conclusion L-CN preconditioning can attenuate the myocardium injury by inhibiting oxidative stress and increasing the anti-oxidative capacity to the isolated rabbit heart undergoing cardiac ischemia due to high potassium-induced cardiac arrest and reperfusion.

　　Key words: ischemia/reperfusion-induced injury; isolated heart; L-carnitine; preconditioning; rabbit

　　成熟心肌的主要能量来源是脂肪酸,约占总能量来源的60%～80%,且主要是依靠外源性脂肪酸来提供能量。左旋卡尼汀(L-carnitine, L-CN)是人体脂肪酸代谢的必需辅助因子，可以改善心肌缺血时的异常代谢状况，加速脂肪的β-氧化，并增加葡萄糖的氧化利用[1]。本实验应用离体兔心Langendorff灌注模型观察L-CN预处理对高钾停搏离体兔心缺血/再灌注损伤的影响，并探讨其可能的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　采用健康家兔(由徐州医学院实验动物中心提供)12只，雌雄不拘，体重2.2～2.5 kg,平均(2.3±0.2) kg。L-CN为美国Sigma公司产品，2,3,5三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)购自上海国药医药集团公司，SOD、MDA测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其余试剂均为国产分析纯。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 离体心脏灌注模型的制备

　　兔耳缘静脉注射肝素300 U/kg，5 min后击头部致昏,迅速开胸取心连接于改良Langendorff灌注装置上，以95% O2和5% CO2饱和Krebs-Henseleit溶液(K-H液)逆行灌注，温度37℃，灌注压力为750 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)。K-H液成分(mmol/L)：NaCl 118、 KCl 4.7、NaH2PO4 1.19、MgCl2 1.19、CaCl2 2.5、NaHCO3 24.8、葡萄糖1.1、EDTA-2Na 0.125，pH 7.4。

　　1.2.2 实验分组及步骤

　　采用离体兔心Langendorff灌注实验模型,根据预处理药物浓度不同(参见Loster等[2]文献)，随机分成缺血/再灌注组(I/R组)、左旋卡尼汀预处理组(L-CN预处理组)，每组6只。离体心脏以95%O2和5%CO2混合气体饱和的K-H液平衡灌注10 min后，I/R组继续灌注K-H液15 min。L-CN预处理组在平衡灌注后予浓度为5.0 mmol/L的L-CN液续灌15 min。各组均于25 min后灌注4℃标准St.Thomas停搏液(K+ 16 mmol/L)6 ml/min至心脏完全停搏，钳夹灌注管停止灌注,进行45 min缺血和开放灌注管再灌注20 min。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 心肌组织SOD活性、MDA含量

　　再灌注末取左心室心尖部心肌组织，予以液氮冷冻，置深低温(-76℃)冰箱保存备测SOD、MDA含量。

　　1.3.2 梗死面积

　　再灌注末取左心室心肌予以液氮冷冻，置深低温(-76℃)冰箱保存，统一测定梗死面积。

　　1.3.3 心肌存活面积百分比

　　分离左心室，从心尖部向心底部将心室外横切成相等厚度的薄片(1 mm)若干，放入1% TTC磷酸盐缓冲液中(pH=7.40)37℃孵育(15～20 min)，染色过程中不时摇动染色液使之与心肌充分接触。存活心肌呈砖红色，梗死区不着色呈灰白色。把心肌片用水冲去多余的染料，并排置于滤纸上吸干水分，放在玻片上，用Image Master图像分析仪求出存活心肌面积占左心室面积的百分比。

　　1.4 统计学处理

　　全部数据采用±s表示，应用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理，组间比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 L-CN预处理对SOD活性和MDA含量的影响

　　L-CN预处理组的SOD活性明显高于I/R组(P<0.01)， MDA含量明显低于I/R组(P<0.05)。见表1。

　　2.2 L-CN预处理对心肌存活面积百分比的影响

　　L-CN预处理组心肌存活面积百分比高于I/R组(P<0.05)。见表1。表1 2组心肌组织SOD活性、MDA含量及心肌存活面积百分比的比较(略)

　　3 讨 论

　　心肌细胞正常的能量供应是维持心肌正常收缩性能、心肌细胞电生理活动以及心肌细胞内外离子浓度平衡的先决条件。已有报道表明，缺血缺氧可抑制细胞能量生成，能量代谢抑制是细胞缺血缺氧的特征性反应[3]。外源补充L-CN可增加心肌细胞内卡尼汀(CN)含量，在肉碱脂酰转移酶Ⅰ催化下，与脂酰辅酶A形成脂酰肉碱，后者在肉碱-脂酰肉碱转位酶催化下，进入线粒体，经肉碱脂酰转移酶Ⅱ的作用，转变为肉碱和脂酰辅酶A，参加β氧化。使缺血期细胞内积聚的游离脂肪酸(FFA)、 脂酰辅酶A减少，减轻脂酰辅酶A对腺嘌呤核苷酸转移酶和脂酰肉碱转移酶活性的抑制;减轻脂酰肉碱对Na+-K+-ATP酶、肌质网Ca2+-ATP酶活性的抑制，减轻了心肌离子转运障碍，有利于再灌注早期心肌能量生成[4]。谢江等[5]报道,外源补充L-CN可显著减少心肌组织病理学的再灌注损伤，认为L-CN对缺血/再灌注有保护作用，部分可能是由于防止了能量损耗和其抗氧化剂活性。本实验结果显示,L-CN预处理明显提高了高钾停搏离体兔缺血/再灌注心肌的存活面积百分比，提示对高钾停搏离体兔缺血/再灌注心肌有保护作用。

　　心肌缺血/再灌注损伤产生氧自由基的一般过程：心肌缺血时细胞线粒体内ATP降解，黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，后者再灌注时随着供氧，产生大量超氧阴离子(O-2)，进而生成羟自由基;再灌注时，随着供血恢复，中性粒细胞被激活并粘附于血管内皮细胞，也产生氧自由基。因为缺氧时SOD与过氧化氢酶等自由基清除剂已经耗竭，氧自由基不被清除，以致堆积，造成损伤。因自由基引起生物膜脂质过氧化，损伤生物膜，破坏了细胞膜结构的完整，造成心肌形态学变化。测定组织中的SOD活性变化，可以间接反映机体清除氧自由基的能力，MDA是脂质过氧化反应的主要产物，测定组织中的MDA含量可以间接反映脂质过氧化反应的程度和细胞损伤的程度。本实验结果可以看出，L-CN预处理后，MDA的含量明显下降，SOD活性是增高的，说明L-CN可以使SOD活性增加，从而有利于对缺血/再灌注期间产生的大量自由基的清除，从而减轻了心肌的脂质过氧化损伤。与本实验观察到的结果类似，Loster等[2]发现5 mmol/L L-CN可降低再灌注期心肌组织MDA。Irat等[6]研究表明L-CN有抗氧化的作用，它能使红细胞内SOD的活性显著增强，过氧化氢酶的活性降低，能抑制中性粒细胞生成过多的氧自由基，但是否就说明L-CN是一种特定的自由基清除剂，目前尚存争议。已有研究表明，L-CN作为一种有效的氧自由基清除剂，在缓解氧化应激、减少脂质过氧化反应中均具有明显的保护作用[7]。Loster等[2]认为5 mmol/L L-CN并不是作为一种特定的自由基清除剂使缺血/再灌注心肌的脂质过氧化物含量减少，而是因为它改善了心肌细胞的能量代谢，减轻了心肌缺血/再灌注损伤而使MDA含量减少。因自由基清除剂的分子结构一般都含有清除自由基的基团，且较低浓度就能发挥其效应，而L-CN并不具备上述特点。所以结合本实验结果，作者认为L-CN对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用是通过增加SOD含量，减少氧自由基对细胞膜、质膜的攻击，从而保护细胞及细胞器的膜稳定性。

　　L-CN是人体细胞的天然组成成分，已广泛应用于临床，未发现明显的副作用。本实验研究观察到浓度为5.0 mmol/L的L-CN具有抑制氧化应激、提高抗氧化能力、减轻心肌缺血/再灌注损伤的作用，为从能量代谢途径采取心肌保护措施提供了新思路。

　　【参考文献】

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