缺血后处理对再灌注损伤大鼠胃黏膜细胞ERK表达的影响

　　【摘要】 目的 探讨缺血后处理(ischemic post-conditioning, I-postC)对大鼠胃黏膜再灌注(GI-R)损伤的影响及细胞机制。方法 制备胃缺血后处理模型。实验分为3组(n=6): 假手术组(Sham组)、缺血-再灌注组(I-R组)、缺血后处理组(I-postC组)。用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP 缺口末端标记法(TUNEL)检测胃黏膜细胞的凋亡，用免疫组化方法检测胃黏膜细胞增殖及凋亡相关基因p-ERK的表达。结果 与Sham组相比，I-R组胃黏膜细胞凋亡增加及增殖减少，p-ERK表达下调;与I-R组相比，缺血后处理显著降低胃黏膜细胞凋亡率，同时可以增加胃黏膜增殖率及p-ERK的表达。结论 缺血后处理可抑制胃黏膜细胞凋亡，促进细胞增殖。其机制可能与p-ERK的表达上调有关。

　　【关键词】 胃缺血-再灌注;缺血后处理;细胞外信号调节激酶

　　Effects of ischemic post-conditioning on extracellular signal-regulated kinase expression in the gastric mucosa in rats with GI-R injury

　　DING Lei, DU Dongshu, ZHANG Jianfu

　　1. Department of Pathophysiology, Xuzhou Medical College; Xuzhou, Jiangsu 221002, China; 2. Neurobiology Research Center, Xuzhou Medical College; 3. Department of Physiology, Xuzhou Medical College

　　Abstract： Objective To investigate the effects and cellular mechanism of ischemic post-conditioning (I-postC) on I/R-induced gastric mucosal injury in rats. Methods Animal model of gastric I-R injury was established in 18 Sprague-Dawley rats, which were randomly divided into 3 groups: sham group, I-R group and ischemic post-conditioning group (I-postC group). TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) was employed to detect the gastric mucosal cells apoptosis, and employed to detect the immunohistochemistry employed to detect the expression of p-ERK. Results Compared with Sham group, the gastric mucosal cellular apoptosis in I-R group increased, the proliferation decreased, and the expression of p-ERK was down-regulated. Compared with I-R group, ischemic post-conditioning could markedly reduce gastric mucosal cellular apoptosis, and meanwhile increase the proliferation rate of gastric mucosa and promote the protein expression of p-ERK. Conclusion The I-postC inhibites cellular apoptosis and promotes cellular proliferation and its protective mechanism is associated with the up-regulated expression of p-ERK.

　　Key words: gastric ischemia-reperfusion; ischemic post-conditioning; extracellular signal-regulated kinase

　　近年来，探索器官缺血-再灌注(I-R)损伤的特点、规律和发生机制已成为当今医学研究的热点。2003年，Zhao等[1]利用犬心肌梗死模型证实，1 h缺血后再灌注开始前给予3轮再灌注30 s/缺血30 s (R-30 s/I-30 s)处理，明显缩小心肌梗死面积，提出了缺血后处理( ischemic post-conditioning, I-postC)的概念。现在已经在不同动物的心肌、脑组织、肾脏得到证实[ 2-3 ]，但胃缺血后处理鲜见报道。胃黏膜是人和动物体内较易受损的组织，各种严重的应激刺激常可引起不同程度的胃组织缺血而造成胃黏膜细胞的损伤。此前我们的研究已经初步证实缺血后处理对胃黏膜损伤能够起到保护作用[4]，在此基础上我们进一步观察了缺血后处理对胃黏膜组织损伤的影响，试图揭示缺血后处理对胃黏膜损伤的细胞保护机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂

　　抗p-ERK单克隆抗体、小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体(SantaCruz公司);TUNEL原位凋亡检测试剂盒(CHEMICON公司);Power Vision二步法免疫组化检测系统、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、枸橼酸盐缓冲盐溶液(北京中山生物技术有限公司);其他试剂均为市售化学纯。

　　1.2 实验动物及分组

　　成年健康Sprague-Dawley (SD) 大鼠，体质量200～250 g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。实验前禁食24 h，自由饮水。大鼠随机分为3 组(n=6)：① 假手术组(Sham组)，开腹后仅分离腹腔动脉而不夹闭;② 缺血-再灌注组(I-R组);③缺血后处理组(I-postC组)。

　　1.3 动物模型制备

　　1.3.1 大鼠胃缺血再灌注模型的制备

　　按本实验室方法[5]，大鼠经10%水合氯醛(0.3 ml/100 g，ip)麻醉后，仰卧固定于操作板上，消毒后采取腹正中切口，开腹长约3 cm，分离并用无创伤血管夹夹闭腹腔动脉30 min后，去除动脉夹恢复血流，于再灌注后1 h处死动物，快速取胃。

　　1.3.2 缺血后处理(I-postC)模型制备

　　参照文献[1]，夹闭腹腔动脉进行胃缺血30 min 后，即刻松开血管夹灌注20 s，然后再夹闭缺血20 s，如此反复3次(灌注20 s、缺血20 s)作为后处理，后处理操作结束后去除血管夹，并于再灌注1 h后处死动物，快速取胃。

　　1.4 原位凋亡检测

　　胃组织石蜡切片(5 μm)，常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化;双蒸水洗2 min×3次，3% H2O2室温作用10 min;蒸馏水洗2 min×3次，每片组织滴加0.1 mol/L PBS液(pH值为7.5)1∶200新鲜稀释的Proteinase K，37℃ 消化15 min;0.1 mol/L PBS液洗2 min×3次，滴加标记缓冲液保持切片组织湿润，每片组织滴加混合标记液 20 μl(TdT 6 μl + Reaction Buffer 14 μl)，置于湿盒中，37℃标记2 h;0.1 mol/L PBS液洗2 min×3次，滴加封闭液50 μl/片，置于室温30 min;甩去封闭液，不洗，滴加地高辛抗体稀释液(1∶100)20 μl/片，置于湿盒中，37℃反应30 min;0.1 mol/L PBS液洗5 min×4次，DAB显色，镜下观察，显色后自来水冲洗;苏木素复染，充分自来水冲洗，中性树脂封片。光镜下观察到细胞完整、体积缩小固缩成团或形成凋亡小体、胞核呈棕黄色即凋亡阳性细胞。每张切片随机选择5个高倍视野，镜下计数凋亡阳性细胞，并计算凋亡率。凋亡率(%)=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%。

　　1.5 PCNA、p-ERK免疫组化染色

　　胃组织石蜡切片(5 μm)，常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化;双蒸水洗2 min×3次，3%H2O2室温作用10 min，去除内源性过氧化物酶的活性;双蒸水洗2 min×3次，枸橼酸盐抗原热修复15 min;0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，分别加一抗(PCNA 1∶50、p-ERK 1∶50)4℃冰箱过夜。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，加二抗PV-6002室温孵育0.5h ;0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。光镜下观察到胞质或胞核内有黄色或者棕色颗粒者，即为阳性细胞。图像分析仪对阳性细胞数或表达强度分别进行半定量分析，检测胃黏膜细胞PCNA、p-ERK表达。

　　1.6 统计学处理

　　实验数据应用STATA 7.0软件进行统计学处理，数据以±s 表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 缺血后处理对再灌注后胃黏膜细胞凋亡的影响

　　Sham组胃黏膜中可见一些凋亡阳性细胞散在分布于上皮层、黏膜下层与腺区;与Sham组相比，I-R组胃黏膜凋亡阳性细胞密集分布于黏膜上皮层和腺区，细胞凋亡率显著升高;经缺血后处理后，与I-R组相比，I-postC组凋亡率明显降低，凋亡阳性细胞分布范围也较小，但与Sham组相比较仍有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。见表1、图1。

　　2.2 缺血后处理对再灌注后胃黏膜细胞增殖的影响

　　Sham组胃黏膜PCNA阳性细胞(即增殖阳性细胞)在胃黏膜的上中层1/3交界处有少量的表达。与Sham组相比，I-R组可见增殖阳性细胞数明显减少;与I-R组相比，I-postC组增殖阳性细胞数明显增加，但仍然低于Sham组(P<0.05或P<0.01) 。见表1、图1。

　　2.3 缺血后处理对再灌注后胃黏膜细胞p-ERK表达的影响

　　p-ERK阳性细胞主要分布于胃黏膜中下层胃底腺细胞中，p-ERK在胞质、胞核中均有分布。与Sham组相比，I-R组可见p-ERK阳性细胞数明显减少;与I-R组相比，缺血后处理能明显提高复灌早期p-ERK的水平，但依然低于Sham组水平(P<0.05或P<0.01)。见表1、图1。表1 胃黏膜PCNA的阳性细胞数和TUNEL及p-ERK的阳性细胞累积光密度值(略)

　　3 讨 论

　　临床上各种严重的应激性刺激，均可造成体内血液的重新分布，引起不同程度的胃组织缺血而造成胃黏膜的再灌注损伤。延缓和减轻胃黏膜I-R损伤是亟待解决的重要问题，而胃黏膜I-R损伤主要发生在再灌注阶段。所以，如何控制再灌注条件或状态来减轻再灌注损伤，引起了人们的关注。作为一种强有力的内源性保护现象, I-postC为I-R的防治提供了新而有效的方法。

　　本实验室已经证实I-R造成的胃黏膜损伤是由于胃黏膜细胞凋亡和增殖之间的平衡受到破坏引起的[6]，而胃黏膜组织的完整性则取决于胃黏膜细胞凋亡和增殖之间的平衡。在本实验中发现，胃缺血后处理可抑制胃黏膜细胞凋亡、促进胃黏膜细胞增殖。

　　我们分别利用PCNA表达和TUNEL来检测细胞的增殖和凋亡，PCNA是DNA聚合酶的辅助因子，参与DNA合成，能较好地反应细胞增殖情况，TUNEL则是公认的检测凋亡的手段。在本实验中我们发现经过缺血后处理的胃黏膜细胞中PCNA表达明显增多，同时胃黏膜细胞凋亡减少。

　　据文献报道，细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在心、脑等器官的I-R损伤中被激活发挥保护作用[7-8]，在调节胃上皮增生、分化、凋亡中也发挥重要作用[9-10]。本实验室以前的研究中也已经证实细胞外信号调节激酶(ERK)途径在大鼠I-R损伤引起的胃黏膜细胞凋亡具有调节作用[5]。在本实验中我们发现I-R组胃黏膜细胞p-ERK表达较Sham组明显降低，而I-postC组胃黏膜细胞p-ERK表达较I-R组明显增加，提示p-ERK的表达可能具有抑制细胞凋亡、促进增殖的作用。但胃黏膜细胞的凋亡是一个多基因调控的相互作用、相互影响的复杂过程，而不是某一种或某一类基因表达的结果，这其中的机制还有待进一步探讨。

　　综上所述，本实验证实缺血后处理对胃缺血-再灌注损伤具有保护作用，其机制与降低胃黏膜细胞凋亡、促进胃黏膜细胞增殖有关。但对缺血后处理确切机制，以及缺血后处理对细胞保护的远期效果的确认有待更多的实验进一步证明。

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