邻苯二甲酸二丁酯孕期暴露仔鼠阴茎3-磷酸甘油醛脱氢酶表达差异的研究

　　【摘要】 目的 探讨3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)在SD大鼠尿道下裂发生中的作用机制。方法 SD大鼠妊娠14～18天，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)按800 mg/(kg·d)染毒孕鼠，妊娠19天取出胚胎大鼠取阴茎，提取蛋白，比较尿道下裂仔鼠与正常仔鼠阴茎组织中GAPDH的差异。结果 GAPDH在尿道下裂仔鼠阴茎中的表达量明显高于正常仔鼠，GAPDH主要在阴茎上皮细胞中表达。结论 GAPDH可能通过抑制DNA合成和细胞增生发挥生长抑制功能，可能在尿道沟融合障碍过程中起关键作用。

　　【关键词】 邻苯二甲酸二丁酯;尿道下裂;阴茎; 3-磷酸甘油醛脱氢酶;大鼠

　　Differential expression of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase in fetal rat penis following in utero exposure to dibutyl phthalate

　　ZHOU Mingyuan, ZHANG Wei

　　1. Department of Urology, The Affiliated Huai′an First Hospital of Nanjing Medical University, Huai′an, Jiangsu 223300, China; 2. Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu 210029, China

　　Abstract:　Objective To investigate the mechanism of GAPDH in the pathogenesis of hypospadias in rats. Methods Timed pregnant rats were given DBP by gastric intubation at a dose of 0 (control group) or 800 mg/(kg·d) (experimental group) as of gestation day (GD) 14 to 18. On GD 19, the penises of the embryonic rats were obtained and their proteins were extracted to analyze the differential expression of GAPDH in the penis tissues between fetal rats with hypospadia and normal ones.Results GAPDH was expressed a higher level in DBP-treated fetal rat penises compared with normal control group. Immunohistochemical analyses confirmed that GAPDH was mainly located in penis epithelial cells. Conclusion GAPDH may restrain growth by the inhibition of DNA synthesis and cell hyperplasia, which might play a key role in the disturbances during urethral groove fusion.

　　Key words: dibutyl phthalate; hypospadias; penis; glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; rat

　　先天性尿道下裂是小儿泌尿生殖系统最常见的畸形之一，发病率为3‰～7‰，且近年来出现明显的上升趋势。尿道下裂病因不明，已有研究表明其发生与遗传、内分泌和环境等因素有关。邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)是一种常见的环境内分泌干扰物(EEDs)，其毒性效应主要表现为对雄性生殖系统的损害，尤其是影响胚胎期雄性生殖系统发育，导致尿道下裂、隐睾等先天畸形的发生。我们应用DBP建立了大鼠尿道下裂动物模型[1]。本实验对DBP染毒后胚胎与正常胚胎大鼠阴茎组织中3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的差异进行比较，从而发现与尿道下裂发生的相关蛋白质，以期揭示DBP的生殖毒理。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂

　　固相pH梯度胶条(IPG strips，pH3-10，非线性)、硝酸纤维素膜、ECL尿素、固相pH梯度胶条缓冲液(IPG buffer)、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、标准蛋白、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸胺(APS)、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺(TEMED)、甘油、溴酚蓝购自瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司,DBP(分析纯，l kg/L)、3-〔(3-胆酰胺丙基)-二乙胺〕-丙磺酸(CHAPS)、硫脲、碘乙酰胺(IAA)和甲醛购自美国Sigma公司,二硫苏糖醇(DTT)购自上海生工生物工程有限公司;考马斯亮蓝G250、硫代硫酸钠、低熔点琼脂糖均为美国Amreso公司进口分装。GAPDH抗体及β-Actin抗体购自Abcam公司,二抗、多聚赖氨酸、EDTA抗原修复液、抗体稀释液、进口羊血清工作液、浓缩DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物公司,脱脂奶粉购自上海光明牛奶有限公司。

　　1.2 实验动物及处理

　　SPF级SD大鼠，约8周鼠龄,雌性10只，体重(220±20) g,雄性10只，体重(300±20)g，均购自南京医科大学实验动物中心。大鼠饲养于温度为23～25℃、湿度为50%～70%、12 h模拟昼夜的屏障环境中。适应性饲养1周后按1∶2 将雌、雄大鼠合笼，次晨检查雌鼠阴道和鼠笼下方的承粪盘，发现精栓的当天为怀孕0 天(GD0)。确定怀孕后, 将孕鼠随机分为2组(实验组和对照组)，每组5 只鼠。据前期研究, 自GD14～GD18, 每天上午9: 00两组大鼠灌胃1 次。将DBP用精制大豆油调整浓度至200 g/L给实验组大鼠灌胃，灌胃容积为4 ml/kg;对照组按同样体积给予大豆油灌胃。GD19取2组雄性仔鼠阴茎，将每只胎鼠的阴茎一部分置于新鲜配制的多聚甲醛中固定，用于免疫组化检测，另一部分置于冻存管并保存于液氮内，用于Western blotting检测。

　　1.3 蛋白质提取

　　取出阴茎样品, 每组各3份，分别加入约2倍体积的裂解液，IPG缓冲液(pH 3～10)、4%CHAPS、1%DTT, 同时加入1 mmol/L PMSF(蛋白酶抑制剂)。将样品和裂解液混合物以11000 r/min×2 s×12次匀浆, 然后4℃摇床振摇1 h，再以40 000 r/min 4℃离心1 h，取上清分装成40 μl， 同时测定蛋白浓度，-70℃保存。

　　1.4 免疫反应

　　根据实验组和对照组的蛋白浓度，调整电泳的上样量，用恒流10 mA进行电泳，完毕后进行转膜，再将硝酸纤维膜转移至5%脱脂牛奶溶液中，室温下，脱色摇床上摇动封闭2 h。用5%脱脂牛奶按1∶2000稀释“一抗”原液〔兔抗鼠GAPDH多克隆抗体(ab21965)〕，封口膜固定，4℃脱色摇床上孵育过夜。设β-Actin为内参，加入抗β-Actin抗体(ab6276)，用TBS清洗硝酸纤维膜，室温下，脱色摇床上摇动10 min×4次。用5%脱脂牛奶按1∶5000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，封口膜固定，37℃杂交炉孵育1 h。用TBS清洗硝酸纤维膜，室温下，脱色摇床上摇动10 min×4次。

　　1.5 免疫组化

　　标本经4%多聚甲醛固定24 h以上，洗净的载玻片用多聚赖氨酸溶液(以1∶10比例三蒸水稀释)包被5 min行防脱片处理后，行石蜡包埋并切片，切片厚约4 μm。65℃烘片1 h，脱蜡至水。消除内源性过氧化物酶。实验组：加一抗配置1∶2000兔抗鼠GAPDH多克隆抗体〔GAPDH多克隆抗体1 μl+含1%BSA的0.01 mol/L PBS液(3 μl BSA+300 μl 0.01mol/L PBS)200 μl〕，用滤纸吸干标本周围液体，吸取适量上述一抗液滴加在标本上。对照组：吸取0.01 mol/L PBS液滴加在标本上，尽量呈水滴状，完全覆盖标本，避免干片。各组加入二抗：配置1∶1000兔抗羊辣根过氧化物酶标记的二抗〔二抗1 μl+含1%BSA的0.01 mol/L PBS液1000 μl〕，用滤纸吸干标本周围液体，吸取适量上述二抗液滴加在标本上，尽量呈水滴状，完全覆盖标本，避免干片。

　　2 结 果

　　2.1 GAPDH表达量

　　运用Western blotting，我们验证了GAPDH在实验组及对照组胎鼠阴茎中的表达量，结果表明对照组和实验组内参β-Actin的亮度比较一致，GAPDH在实验组的亮度高于对照组。见图1。

　　图1 2组GAPDH蛋白表达Western blotting检测

　　2.2 免疫组化

　　通过免疫组化方法，我们发现GAPDH主要定位在胎鼠阴茎上皮细胞中，阴茎的其他细胞均未见明显染色。比较可发现，对照组阴茎上皮细胞内GAPDH的染色强度明显弱于实验组，这与蛋白电泳结果是一致的(图2)。

　　3 讨 论

　　尿道下裂是男性生殖系统的常见畸形之一，在我国发病率有逐年上升的趋势[2]。其病因是多方面的，如内分泌因素、环境、类雌激素的破坏作用等[3]。贺厚光等[4]成功应用氟他胺及邻苯二甲酸二丁酯建立小鼠尿道下裂模型。已有研究表明，DBP导致大鼠尿道下裂的发生是通过抑制睾丸胆固醇转运及类固醇激素合成途径中多种相关酶和因子的表达而直接干扰睾丸睾酮和双氢睾酮的合成。由于胚胎组织中睾酮水平降低，由睾酮和双氢睾酮介导的性分化被阻断，雄性外生殖器分化受到抑制,最终导致尿道下裂等生殖系统畸形的发生[3]。多项研究结果提示DBP可能通过干扰胎鼠睾丸细胞凋亡通路造成胎鼠睾丸的发育不良。通过对尿道下裂阴茎和正常阴茎从阴茎顶端到根部的相同层面的病理切片比较发现：在正常阴茎中，尿道轴位于阴茎体的中央，开口于阴茎的顶端;而尿道下裂雄鼠阴茎尿道轴偏向阴茎的腹侧并且开口于阴茎的腹侧，腹侧包皮缺如[5]。研究表明，DBP通过抑制睾丸内胆固醇转运及类固醇激素合成而直接干扰睾丸睾酮和双氢睾酮的合成。胚胎组织中睾酮水平降低，由睾酮介导的性分化被阻断，最终导致尿道下裂、肛门生殖器距离缩短等生殖系统畸形的发生。

　　已有研究证实尿道下裂大鼠与正常大鼠的睾丸蛋白质有多个差异点，表达上调的蛋白有膜联蛋白V(annexin V，Anx-V)、过氧化物酶6(peroxiredoxin 6，Prx6)等，表达下调的蛋白有泛素羧基末端水解酶L1、αB-晶体蛋白等[6]。沈华等[7]通过研究证实邻苯二甲酸二丁酯诱导尿道下裂大鼠与正常大鼠阴茎组织亦有多个差异蛋白，其中表达上调的有丙酮酸激酶M2、Ot-烯醇化酶、核蛋白Hcc-1等，表达下调的有膜联蛋白A3(AnxA3)、Echl蛋白等。通过本实验我们验证了GAPDH含量在尿道下裂大鼠阴茎组织中明显高于正常大鼠，免疫组化证实其定位于阴茎上皮细胞中。在马隆等[8]研究DBP诱导雄性大鼠尿道下裂发生的分子机制中，认为DBP通过对生殖结节(GT)生长发育早期的Shh信号系统，以及晚期的雄激素信号系统发生作用而影响GT的生长发育，诱导尿道下裂的发生。

　　GAPDH作为糖酵解的一个关键酶与丙酮酸激酶有非常密切的关系，二者在组织代谢中表现为同时增高或降低。有研究证明丙酮酸激酶具有抑制DNA合成和细胞增生的作用[7]，本实验证实尿道下裂大鼠阴茎组织中GAPDH明显高于正常大鼠，可能通过引起丙酮酸激酶的上调而抑制DNA合成和细胞增生，表现出生长抑制功能，可能在尿道沟融合障碍过程中起了重要作用。

　　新近的研究表明GAPDH并不是单纯的糖酵解蛋白，还具有膜转运活性、 微管成束活性、 参与细胞凋亡以及在细胞核内的功能等[9]，这些功能是否与尿道下裂的发生相关还有待于进一步的证实。

　　【参考文献】

　　[1]袁琳，贺厚光，龚永光，等. 邻苯二甲酸二丁酯诱发大鼠尿道下裂模型的建立[J].南京医科大学学报:自然科学版,2005, 25(5)：341- 342.

　　[2]靳蕾, 叶荣伟, 张卓琳.中国部分地区男性围生儿尿道下裂的流行特征[J] .中国生育健康杂志，2008，19(5)：284-288 .

　　[3]贺厚光，张炜. 尿道下裂病因学研究进展[J].国外医学·泌尿系统分册，2004，24(3)：296-298.

　　[4]贺厚光, 张炜，朱佳庚，等. 小鼠尿道下裂动物模型的建立[J]. 中华男科学, 2004, 10(3)：172-174.

　　[5]蒋君涛，马隆，吴婷，等. 邻苯二甲酸二丁酯致尿道下裂大鼠发育异常和阴茎病理学改变研究[J]. 中华实验外科杂志,2006 , 23(5)：576-578.

　　[6]蒋荣江,沈华，沈百欣，等. 尿道下裂大鼠与正常大鼠睾丸蛋白质二维电泳图谱分析[J]. 南京医科大学学报：自然科学版, 2007, 27(12)：1363-1365.

　　[7]沈华，张炜，吗隆，等. 邻苯二甲酸二丁酯诱导大鼠尿道下裂发生的阴茎组织差异蛋白质组分析[J]. 中华实验外科杂志, 2007, 24(11)：1410.

　　[8]马隆，蒋君涛，吴婷，等. 邻苯二甲酸二丁酯诱导雄性大鼠发生尿道下裂的分子作用机制[J]. 中华实验外科杂志, 2007, 24(8)：970-972.

　　[9]李洁，谢文光，沈倍奋，等. GAPDH功能多样性研究进展[J]. 军事医学科学院院刊,2006, 30(5)：483-486.