广防己配伍黄芪肾毒性的代谢组学研究

　　【摘要】 利用代谢组学技术研究大鼠口服广防己及其配伍黄芪水煎液后尿液代谢图谱的变化，探讨黄芪配伍广防己对肾脏的减毒作用。[方法]雄性wistar鼠24只随机分为正常对照组、广防己组、广芪组，每组8只。广防己组按8.1g/kg，广芪组按9.1g/kg灌胃给药，正常对照组灌服等体积蒸馏水。连续给药4w后，收集大鼠24h尿液，测定尿液1HNMR谱;取血做BUN、SCr检测;取肾脏行组织病理学检查。[结果]给药4w时，广防己组BUN、SCr显著升高(P<0.01)，肾组织呈现明显的病理改变;广芪组SCr水平较广防己组明显降低(P<0.05)，肾组织病变范围及程度较广防己组轻。尿代谢图谱经主成分分析表明，广防己组尿中柠檬酸、2酮戊二酸、马尿酸盐、葡萄糖含量降低;TMAO、肌酸·肌酐含量升高。广芪组上述代谢物的变化呈不同程度地减小。[结论]广防己给药4w可造成肾功能的明显损害，配伍黄芪有一定的对抗其损伤的作用。

　　【关键词】 广防己;黄芪;中药配伍;肾毒性;代谢组学;核磁共振;模式识别

　　Nephrotoxicity Study of Aristolochia Fangchi and it’s Compatible with Astragali Radix in Rats by Metabonomics Liang Qi　 Xie Ming　　 Ni Cheng　 et al epartment of Formulaology, BeiJing University of Chinese Medicine (100029), China; 　National Center of Biomedical AnalysisAbstract: [Objective] Study the metabonomics profile of in the urine samples of rat dosed with decoctions of Aristolochia fangchi and it’s compatible with Astragali radix. To found that the inhibition effect on Nephrotoxicity of Aristolochiae fangchi by compatible with Astragali radix. [Method]24 Male Wistar rats were divided to three groups, the G group were administrated by 8.1g/kg-1 of Aristolochia fangchi, the GQ group were administrated by 9.1g/kg-1 of Aristolochia fangchi compatible with Astragali radix, and the control group by equal volume of distilled water for 4 weeks. On the 4th weekend, urine was collected and their 1HNMR spectra were acquired, and then subjected to data process and principal component analysis (PCA, PLSDA or OSC). Blood biochemical analysis and histopathological examination were carried out. [Results]The BUN and SCr of G group were markedly higher than those of the control group (P<0.01) with pathological in kidney. Matching with Astragali radix decreased the SCr (P<0.05) and mitigated the kidney pathological of G group, compared to control group, the urinary concentrations of citrate, 2oxoglutarate, Hippurate, Glucose in G group decreased, while the TMAO and Creatinine/Creatine increased. Those changes of metabolites in GQ group were lighter than that in the G group. [Conclusion] The Aristolochia fangchi can induce renal lesion as revealed by the metabonomic analysis of rat urine samples as well as blood biochemical analysis and histopathological examinations. Compatible with Astragali radix has some inhibition effect on renal toxicity of Aristolochiae fangchi.

　　Key words:Aristolochia Fangchi; Astragali radix; compatibility; nephrotoxicity; metabonomics; nuclear magnetic resonace(NMR); pattern recognition

　　在常规毒理研究的基础上，运用代谢组学技术手段，比较观察了广防己及其配伍黄芪的肾毒性，以观察黄芪配伍广防己可能具有的减毒作用。

　　1 材料

　　1.1 动物

　　SD大鼠，雄性，SPF级，体重(130±10)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。北京中医药大学动物饲养房(屏障系统)饲养，自然明暗周期,室温24℃,湿度：55%，动物提前1w购入，常规饲养，自由摄食、饮水。

　　1.2 药材

　　广防己购自广东省广州市中药材批发市场，黄芪购自北京同仁堂药材有限公司，均由北京中医药大学中药学院生药学系刘春生教授鉴定，广防己为马兜铃科广防己Aristolochia fangchi Y.C.Wu ex L.D.Chou et M.Hwang的干燥根。采用HPLC方法测得马兜铃酸含量为0.457mg/g。黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.var mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根，HPLC方法测得黄芪甲苷0.540mg/g。

　　1.3 水煎剂

　　取广防己药材2000g，标记为药材a，另取广防己药材2000g，黄芪药材250g，合并标记为药材b。分别将药材a、b分别置于提取罐中，加相当于药材10倍体积的冷水浸泡1h，加热至沸腾，煎煮1h，倾出药液，残渣加入9倍体积的水，煎煮1h后取药液，合并2次药液，过滤。其中水煎剂a减压浓缩至2469ml药液，相当于1ml含生药0.81g，采用HPLC方法测得其马兜铃酸含量为0.319mg/ml;水煎剂b减压浓缩至2473ml药液，相当于1ml含生药0.91g，采用HPLC方法测得其马兜铃酸含量为0.192mg/ml。二种水煎液均置4℃冷藏，备用。

　　1.4 仪器

　　Varian UNITY INOVA 600兆超导脉冲傅里叶变换NMR谱仪,美国Varian公司产品;7020全自动生化分析仪,日本日立公司产品。

　　2 方法

　　2.1 动物分组及处理

　　大鼠随机分为正常对照组、广防己组、广芪组三组，每组8只。广防己组、广芪组动物均按1ml/kg给以相应药物灌胃，每日1次,连续给药4w。正常对照组给予等体积蒸馏水。给药期间,大鼠自由摄食、饮水。于4w末，分别留取各组大鼠24h尿液，10%的水合氯醛麻醉处杀大鼠，取血浆及肾脏组织。

　　2.2 尿液收集和处理

　　于动物处理前一天，采用代谢笼法，收集24h尿液，留尿期间动物不摄食，自由饮水。代谢笼集尿器置于冰上，加入1% NaN3溶液作为防腐剂。对收集的尿液进行定量，离心处理，取上清，置-70℃保存，备用。

　　2.3 血浆收集与处理

　　离心制备血浆，全自动生化分析仪测定血尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)水平。

　　2.4 数据处理

　　所得数据均用均数±标准差(x±s)表示，组间差异采用q检验，由SPSS13.0统计软件处理。

　　2.5 肾脏病理学检查

　　各组大鼠肾脏用生理盐水冲净后，按HE常规制片，于光镜下观察。

　　2.6 代谢组学测定与分析

　　2.6.1 NMR测量前尿样准备

　　各组取5个尿液样本常温解冻，精密吸取300μl尿样，加入300μl缓冲液(0.2M Na2HPO4/NaH2PO4,pH7.4),混匀，13000rpm，10min离心，取上清500μl,添加30ul 1%TSP;转入5mm样品管中进行测试。

　　NMR数据采集与分析：数据在Varian UNITY INOVA 600超导脉冲傅里叶变换NMR谱仪上采集。采用有预饱和的1D NOESY脉冲序列，取如下参数：谱宽7996 Hz，混合时间0.100s，弛豫延迟时间2s，采样点数64000，累加次数64次;在弛豫延迟期间和混合时间内采用预饱和方式抑制水峰，谱仪偏置设置在水峰的位置。FID信号经过傅里叶变换转换为NMR图谱，所用窗函数为0.5Hz线增宽因子。以TSP为化学位移参考峰的位置，并定为δ0。利用VNMR软件的宏指令将数据进行FT变换，相位校正，基线校正。将d0.2～9.4范围内的谱图按每段0.04ppm进行分段并积分，同时排除以溶剂峰为中心的部分及包含尿素峰的部分(d4.6～6.2)。因柠檬酸受pH值影响较大，为保证分析结果一致，将柠檬酸积分δ2.54与δ2.58合并，标示为δ2.56，将δ2.66与δ2.7合并，标示为δ2.68，其余不变。

　　2.6.2 结果分析

　　将所产生的所有积分数据归一化，均以Excel文件格式贮存。得到的数据文件利用SIMCAP10.0软件包(瑞典,Umetrics AB,Umea)进行PCA、PLSDA、OSC等模式识别分析。

　　3 结果

　　3.1 广防己及其配伍黄芪给药4w大鼠BUN和SCr的变化

　　见表1。表1 给药4w时各组大鼠BUN、SCr的变化(略)

　　与正常对照组比较，**P<0.01;与广防己组比较，●P<0.05

　　3.2 广防己及其配伍黄芪给药4w时大鼠肾脏组织病理学变化

　　结果见图1。镜下可见，给药4w时正常对照组大鼠肾小球球囊结构完整，无系膜细胞增生，肾小管结构清晰，肾间质无炎性细胞浸润(图1A)。广防己组大鼠肾小球结构破坏明显，其囊壁与周围组织粘连，肾小管上皮细胞肿胀、溶解坏死，肾间质炎性细胞浸润(图1B);广芪组大鼠肾间质炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀、坏死，但较广防己组病变范围小、程度轻(图1C)。

　　3.3 广防己及其配伍黄芪给药4w时大鼠尿样1H NMR图谱及模式识别分析.

　　3.3.1 广防己及其配伍黄芪给药4w时大鼠尿样1H NMR图谱，结果见图2。广芪组(GQ)大鼠尿液(u)1H NMR图谱

　　3.3.2 广防己及其配伍黄芪给药4w时大鼠尿样模式识别分析结果，结果见图3。

　　由图3可以看出，给药4w时，正常对照组、广防己组、广芪组大鼠尿液1H NMR图谱波峰PC积分值互不重叠，能够被区分开来，表明各组大鼠尿液代谢物存在差别。结合图2可以看出，广芪组较广防己组接近正常对照组。表明广防己组尿液代谢物较广芪组异常变化明显。

　　4 讨论

　　本研究则在前期发现广防己水提物按10倍药典高限剂量给药4w可造成大鼠肾脏组织明显病理改变[1]的基础上，进一步引入代谢组学技术，通过比较观察广防己与其配伍黄芪的肾脏毒性，探讨黄芪监制广防己毒副作用的内涵。

　　结果显示，广防己和广防己配伍黄芪二组给药4w时BUN、SCr较正常对照组均明显升高，肾组织出现不同程度的病理改变;较之广防己组，广芪组SCr明显降低，BUN无明显变化，肾组织病理改变减轻。结果表明，实验剂量的广防己给药4w具有明显的肾毒性作用;配伍黄芪能减轻广防己的肾毒性，主要表现为对抗广防己的肾滤过功能损伤的作用。

　　本研究发现，广防己给药4w尿代谢物出现明显变化，其中柠檬酸、2酮戊二酸、马尿酸盐、葡萄糖的下降，TMAO、肌酸/肌酐含量均升高。结果提示，广防己对肾脏的损伤涉及到肾小管重吸收、肾小球及肾髓质功能。广防己配伍黄芪可使广防己组中降低的马尿酸盐、葡萄糖，升高的肌酸/肌酐恢复正常;降低的柠檬酸、2酮戊二酸，升高的TMAO含量接近正常水平，表明黄芪有对抗广防己的肾损害作用。

　　【参考文献】

　　1]倪诚.广防己和粉防己及其配伍黄芪的效毒研究[D].北京中医药大学博士研究生学位论文，2007.