姜黄素对哮喘大鼠肺内粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达及气道炎症的影响

　　【摘要】 目的 通过观察姜黄素对哮喘大鼠肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞(Eos)计数、肺组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)表达的影响,探讨姜黄素对哮喘的治疗作用。方法 36只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、姜黄素治疗组(C组)各12只,采用卵蛋白(OVA)致敏大鼠哮喘模型,观察三组动物哮喘发作症状、肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数情况及原位杂交方法检测肺组织中GM-CSFmRNA含量变化。结果 B组大鼠哮喘发作症状最明显,C组大鼠症状轻,A组无症状。B组肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数均明显高于其余两组; C组明显少于B组; A组最少。肺组织中GM-CSFmRNA表达A组微弱表达, C组较强, B组表达最强。结论 姜黄素可抑制哮喘大鼠的气道炎症,其作用机制可能是通过抑制GM-CSF的表达而导致嗜酸性粒细胞生成减少及存活时间缩短来实现。

　　【关键词】 姜黄素 哮喘 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 气道炎症

　　Effects of curcumine on granulocyte macrophage colony stimulating factor expression and airway inflammation in asthmatic rats

　　WU Dong, et al.

　　Department of Respiratory Diseases, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong 524001 China

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of curcumine on granulocyte macrophage colony stimulating factor expression and airway inflammation in asthmatic rats. Methods 36 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control(A group), model group(B group),curcumine group(C group), 12 rats in each group. Rats were sensitized and challenged continually with ovalbumin(OVA) for the purpose of induction of asthma in rats. To observe asthmatic attack and airway inflammation in asthmatic rats. Granulocyte macrophage colony stimulating factor in rat pulmonary tissues was detected by using in situ hybridization method. Results Asthmatic attack obviously in B group，gently in C group, Absence of symptoms in A group. The total cell amount in bronchoalveolar ravage fluid and eosin Phil were obviously higher in B group than C group and A group. The expression of GM-CSFmRNA in C group was significantly higher than that in A group and it was lower than that in B group.Conclusions The effect of curcumine on airway inflammation in asthmatic rats may be correlated with its inhibition on over expression of GM-CSF in lung tissue.

　　【Key words】 Curcumine Asthma Granulocyte macrophage colony stimulating factor Airway inflammation

　　支气管哮喘是一种特殊的气道炎症,主要表现为气道高反应与变异性较大的可逆性气流阻塞。有研究表明[1]，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在炎症过程中起核心作用。姜黄素因其在抗炎、抗纤维化、抗肿瘤、抗氧化等作用而倍受学者们的关注[2]。本研究通过观察姜黄素对哮喘大鼠气道炎症、肺组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)表达的影响,探讨姜黄素对哮喘的治疗作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物来源及分组

　　雄性SD大鼠36只,体质量150～200g,由广东医学院实验动物中心提供。随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、姜黄素治疗组(C组)各12只。

　　1.2 试剂与药品

　　98%纯度姜黄素由广东医学院天然药物开发中心提供。卵白蛋白(Ovalbumin,OVA,V级):美国Sigma公司; GM-CSF探针由上海生物工程技术有限公司合成，探针序列为3-CTGACGACCCTCGCTGGT-CAGGTCC-5'。

　　1.3 模型的建立

　　参照文献[3]方法进行。实验的第1、3天,B、C组大鼠腹腔注射抗原液1ml(含卵蛋白100mg,灭活百日咳杆菌疫苗5×109个,氢氧化铝干粉100mg)致敏, A组用等量的生理盐水替代抗原液。第10天后,B、C组以1%卵蛋白溶液雾化吸入,30min激发,动物出现打喷嚏、呼吸频率加快、幅度加大、腹式呼吸明显等症状。以后每天激发1次,共15次。C组大鼠于每次激发前20min胃饲姜黄素200mg/kg药液,B组大鼠鼻饲等量生量盐水。第24天取材。

　　1.4 标本采集

　　末次激发后2～4h内处死大鼠。开胸,取右肺脏冷生理盐水清洗后,置于-60℃冻存备用。

　　1.5 肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数

　　气管插管，用生理盐水5ml注入左侧气管肺组织内，反复抽吸3次，回收率80%以上，将抽取得肺泡灌洗液取20μl用以细胞记数，剩余放入离心管中，100r/min，离心后沉淀用1ml生理盐水稀释，涂片，瑞氏-姬姆萨染色计数100个细胞观察细胞分类情况。

　　1.6 肺组织GM-CSFmRNA原位杂交检测

　　取肺组织冰冻切片,0.1MPBS漂洗5min,0.3%TritonX-100 20min,蛋白酶K(2ng/ml)37℃,30min,4%多聚甲醛5min,(1.33%三乙醇胺+0.25%乙酸酐)/0.1MTris-HCL,pH 8.0 10min,2×SSC漂洗10min,杂交液(每片加含有GM-CSF探针标记液20μl),45℃下,20h,4×SSC,37℃下、15min,2×SSC,37℃下,30min,依次转入1×SSC、0.5×SSC,37℃下各10min,0.5MPBS漂洗5min,加Anti-Dig-Ap抗(1∶1000)37℃下,1h,转入4℃下,20h,TSM1、TSM2各10min,NBT/BCIP显色3～4h,0.05MPBS漂洗,终止反应,中性树胶封片。杂交前所需液体及试剂均需DEPC无RNAase处理。

　　1.7 统计学方法

　　结果以(x±s)表示,应用sas 8.1软件包进行单因素方差分析、F检验、相关分析。P<0.05认为组间有显著性差异,P<0.01认为组间有极显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 大鼠哮喘症状发作程度

　　于第1次激发后,B、C组大鼠出现明显呼吸变促、烦躁、打喷嚏等症状。连续抗原激发后,B组大鼠症状严重,即刻出现喷嚏,烦躁不安,呼吸急促,有喘鸣音,严重者出现行动迟滞,反应迟钝,且持续时间长。A组无症状,C组大鼠症状较轻,表现为气促、烦躁。

　　2.2 哮喘大鼠肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数

　　哮喘模型组总细胞数及嗜酸性粒细胞数均明显高于姜黄素组及对照组，差异有统计学意义(P<0.01),见表1。表1 各组大鼠肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数情况 (略)注：*与哮喘模型组比较P<0.01;**与对照组比较P<0.01。

　　2.3 哮喘大鼠肺组织GM-CSFmRNA的表达情况

　　肺组织中GM-CSFmRNA表达A组微弱表达, C组较强, B组表达最强。见表2。表2 各组大鼠肺组织GM-CSFmRNA的表达情况(略)注：*与哮喘模型组比较P<0.01;**与对照组比较P<0.05。

　　2.4 相关分析

　　大鼠肺组织GM-CSFmRNA表达值与大鼠肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数情况呈显著正相关(分别为r=0.63，P<0.01,和r=0.85,P<0.01)。

　　3 讨论

　　哮喘是一种慢性炎症反应性疾病，由多种细胞浸润，多种炎性因子，炎性介质参与炎症反应，这种炎症是哮喘气道高反应性，气道重塑的基础。本实验发现肺泡灌洗液中哮喘模型组细胞总数、嗜酸性粒细胞明显增高，与对照组相比有显著差异;符合支气管哮喘病理生理改变,与文献报道哮喘模型的变化结果一致[3],说明本实验模型是成功的。

　　粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)由T淋巴细胞受到抗原刺激后而产生，特异性地作用于嗜酸性粒细胞(Eos)生成与分化的各个阶段[4]。GM-CSF本身不能损伤气道上皮,但可通过促进Eos的产生、活化及介质释放等作用;而且GM-CSF可延长Eos的存活时间,使正常密度Eos转化为低密度表型,增加Eos对趋化因子的反应[5]，在哮喘的气道炎症中发挥重要作用。

　　姜黄素是从姜黄中提取的一种植物酚，无毒，作为食品色素被广泛应用，现代研究认为姜黄素是一种安全有效的抗癌、抗炎、抗氧化，保护肝肾抗纤维化，抑制IL-5和GM-CSF的合成，抑制平滑肌的收缩等多种药理作用的药物[6]。姜黄素对多种炎症性疾病都具有治疗作用，并且对胃没有明显的刺激，对心血管及中枢神经系统亦无影响[7]。因此，有望成为治疗炎症性疾病的有效药物。

　　本研究发现，哮喘大鼠肺组织中GM-CSFmRNA表达明显高于其它两组,并与反映大鼠气道炎症的指标：肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数情况呈显著正相关。这很可能是哮喘气道炎症形成的重要原因之一。而姜黄素通过抑制GM-CSF的表达而导致嗜酸性粒细胞生成减少及存活时间缩短，在一定程度上抑制了哮喘大鼠的气道炎症，从而减轻哮喘的发作;但其具体机制尚需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Corrigan CL,Kay AB.CD4T-Lymphocyte activation in acute servere asthma[J].Am Rev Respir Dis，1990，141:970

　　[2]Egan M,Pearson M,Weiner SA,et al. Curcumin,a major con-stituent of turmeric,corrects cystic fibrosis defects[J].Sciences,2004,304(5670):600-602

　　[3]吕国平,崔德健,郭英江.介绍一种大鼠哮喘模型的实验方法[J].中华结核与呼吸杂志,1995,18(5):377

　　[4]Shimada M, Minato M, Takado M, et al. Plasma concentrations of granulocyte colony-stimulating factor in neonates[J].Acta Peadiatr，1996,85(3):351-355

　　[5]Rand AT,Warringa LK,Paul TMK,et al.Modulation and induction of eosinophil chemotaxis by Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating factor and interleukin-3[J].Blood，1991，77:2694

　　[6]Suryanarayana P,Saraswat M,Krishna TP,et al. Curcumin and turmeric delay streptozotocin-induced diabetic cataract in rats[J].Investigative Ophthalmology&Visual Science,2005,46(6):2092-2099

　　[7]Ringman JM,Frautschy SA,Cole GM,et al. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease[J].Curr Alzheimer Res,2005,2(2):131-136