融合基因GMCSFBZLF1重组腺病毒表达载体的构建

　　【摘要】 目的 构建粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和EB病毒即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 采用逆转录聚合酶链反应分别获得GMCSF和BZLF1编码序列的cDNA，应用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因GMCSFBZLF1。将融合基因GMCSFBZLF1定向亚克隆至pAdTrackCMV质粒，在原核细胞E. coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因GMCSFBZLF1真核表达载体pAdGMCSFBZLF1。将真核表达载体pAdGMCSFBZLF1转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAdGMCSFBZLF1。RTPCR鉴定感染重组腺病毒的293细胞中GMCSFBZLF1基因的表达。结果 GMCSFBZLF1基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置，且插入序列完全正确;感染重组腺病毒vAdGMCSFBZLF1的293细胞中检测到融合基因GMCSFBZLF1的转录表达。结论 成功地构建了融合基因GMCSFBZLF1重组腺病毒表达载体，为进一步探讨GMCSFBZLF1的功能提供了理论基础和实验依据。

　　【关键词】 疱疹病毒4型，人;粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;基因，即早;基因融合;遗传载体

　　CONSTRUCTION OF RECOMBINANT ADENOVIRUS EXPRESSION VECTOR ENCODING GMCSFBZLF1 FUSION GENE CUI YING, WANG YUN, LIU CHENGYU, et al (Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China); [ABSTRACT] Objective To construct human granulocytemacrophage colonystimulating factor (GMCSF) gene and EBV encoding immediate early genes (BZLF1) fused to GMCSFBZLF1 gene and the fusion gene recombinant adenovirus expression vector. Methods GMCSF cDNA and BZLF1 cDNA were acquired by RTPCR. The fusion gene GMCSFBZLF1 was constructed through a polypeptide linker (Gly4Ser) 3 by using spliced overlap extension (SOE). The fusion gene GMCSFBZLF1 was subcloned into pAdTrackCMV plasmid. The shuttle plasmid and the backbone plasmid pAdEasy1 were recombinated homologously in E.coli BJ5183 cells, then fusion gene eukaryotic expression vector pAdGMCSFBZLF1 were constructed. pAdGMCSFBZLF1 vector was transfected into 293 cells to obtain recombinant adenovirus vAdGMCSFBZLF1. RTPCR was used to identify the expression of fusion gene GMCSFBZLF1 in 293 cells infected with vAdGMCSFBZLF1. Results The result of DNA sequencing demonstrated that GMCSFBZLF1 gene inserted in the expected site in the recombinant adenovirus expression vector and the insertion sequence was wholly correct. The expression of fusion gene GMCSFBZLF1 could be detected in the 293 cells infected with vAdGMCSFBZLF1. Conclusion The fusion gene GMCSFBZLF1 recombinant adenovirus expression vector has been constructed successfully, which might furnish the rationale and experimental evidence for further study on the function of GMCSFBZLF1 gene.

　　[KEY WORDS] herpesvirus 4, human; granulocytemacrophage colonystimulating factor; genes, immediateearly; gene fusion; genetic vectors

　　EB病毒(EBV)是嗜B淋巴细胞的疱疹病毒，为致瘤病毒之一。文献报道，该病毒与多种人类恶性肿瘤如BURKITT淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)、霍奇金病、免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤及胃癌等发生有关[14]。HOSHIKAWA等[1]研究表明， EBV基因组存在于几乎所有EBV阳性癌组织的癌细胞中，提示EBV可能是治疗EBV阳性肿瘤的理想靶点。EBV即刻早期基因(BZLF1)是诱导潜伏期病毒活化进入裂解期的关键基因，其编码蛋白为转录激活因子，可激活病毒早期基因和晚期基因使病毒进入裂解期进行复制。EBV大量增殖后经细胞膜释放可导致肿瘤细胞溶解死亡，起到选择性杀伤EBV阳性肿瘤细胞的作用[5]。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生，是一种具有多种生物学活性的细胞因子，将GMCSF基因转入肿瘤细胞内，可以提高其免疫原性从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答[6]。本研究拟将GMCSF编码基因和BZLF1进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，深入探讨融合基因表达对EBV阳性肿瘤细胞增殖的影响，从而为基因联合治疗EBV相关肿瘤提供实验基础和理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂、质粒和细胞系

　　限制性核酸内切酶EcoRⅤ和BglⅡ，T4 DNA连接酶，DL 10 000 DNA Marker，DL 2 000 DNA Marker，Taq DNA聚合酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA转染试剂盒Lipofectamine 2000 购自Invitrogen公司;质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。DMEM培养液、TRIzol、胎牛血清购自美国GIBCO公司。反转录酶为Promega公司产品。QIAEXⅡ纯化试剂盒购自QIAGEN公司。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1 区和E3 区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdEasy1，大肠杆菌BJ5183和DH10B以及人胚肾293细胞，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。EBV阳性B958细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。

　　1.2 引物设计

　　根据GMCSF和BZLF1开放读码框序列，以DNAStar软件设计扩增人GMCSF和EBV BZLF1 基因的特异性引物，并在GMCSF上游引物的5′ 端引入BglⅡ酶切位点和保护性碱基GA，下游引物3′ 端删除终止密码TGA，引入linker;BZLF1下游引物5′ 端引入EcoRⅤ酶切位点和保护性碱基GC，上游引物3′ 端引入linker。linker(Gly4Ser)3为编码15个氨基酸组成的疏水性多肽的DNA 序列，序列为5′GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC3′。GMCSF引物(上游P1、下游P2)和BZLF1引物(上游P3、下游P4)序列见表1。上述序列中下划线部分为linker，黑体部分为酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(PAGE纯化)，扩增产物GMCSF长为470 bp，BZLF1长为785 bp，融合基因长为1 210 bp。

　　1.3 GMSCF和BZLF1基因的扩增

　　取正常人外周抗凝血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞。将收集的单个核细胞加入含有植物血凝素的DMEM培养液中，37 ℃活化24～48 h后收集活化的单个核细胞。采用TRIzol一步法分别提取外周血活化的淋巴细胞总RNA和EBV阳性B958细胞系总RNA，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR反应模板。PCR反应体系为25 μL，其中包括10×buffer 2.5 μL， MgCl21.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，cDNA 2 μL，无菌去离子水补至25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的8 g/L琼脂糖凝胶中电泳30 min，紫外线透射仪下观察电泳结果。切胶回收PCR产物，用QIAEXⅡ纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。表1 BZLF1和GMCSF引物设计名称序列长度GMCSFP1 P1

　　1.4 目的基因的TA克隆和测序

　　分别将GMCSF和BZLF1 PCR的纯化产物与pMD18T载体连接，转化入高效E.coli DH10B感受态细菌中，在含有xgal和IPTG的氨卞青霉素LB平板上进行蓝白斑选择。分别将TAGMCSF和TABZLF1阳性克隆送北京华大基因研究中心进行DNA序列测定，测序结果与GenBank中GMCSF和EBV标准株BZLF1编码基因序列进行比对。

　　1.5 融合基因GMCSFBZLF1的构建

　　以TAGMCSF和TABZLF1质粒为模板进行PCR扩增反应，分别获得带有linker互补序列的GMCSF和BZLF1片段。将GMCSF和BZLF1的PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，以其为模板采用重叠延伸PCR法[7]获得融合基因片段GMCSFBZLF1。重叠延伸PCR反应体系容积为50 μL, 包括10×buffer 5 μL， MgCl2 3 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，上下游引物P1、P4分别为0.5 mmol/L，高保真Taq DNA聚合酶2.5 U，模板2 μL，无菌去离子水补至50 μL。反应条件为：95 ℃预变性2 min;然后95 ℃ 45 s、58 ℃ 45 s、72 ℃2 min，扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。延伸结束以后，向PCR体系中加入dATP 2 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U，继续72 ℃延伸30 min。将纯化后的GMCSFBZLF1融合基因片段插入到pMD18T载体进行TA克隆，提取质粒DNA进行酶切鉴定和DNA序列分析。

　　1.6 重组腺病毒pAdGMCSFBZLF1的构建

　　质粒TAGMCSFBZLF1和腺病毒穿梭质粒pAdCMV分别用EcoRⅤ和BglⅡ进行双酶切，连接后转化DH10B高效感受态细菌中，培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒DNA进行pAdTrackCMVGMCSFBZLF1重组体的PCR筛选及酶切鉴定。

　　重组pAdTrackCMVGMCSFBZLF1质粒用限制性核酸内切酶PmeⅠ酶切线性化，并用碱性磷酸酶将线性化质粒去磷酸化，与1 μL(0.1μg)的pAdEasy1质粒同时转化感受态E.coli BJ5183，将转化的BJ5183 感受态菌液涂布于含35 mg/L卡那霉素的LB平板，37 ℃培养16～20 h。挑取较小菌落，在含卡那霉素(35 mg/L)的LB液体培养基中37 ℃振摇培养12～16 h，碱裂解法小量提取质粒DNA，用限制性内切酶PacⅠ酶切后电泳进行鉴定，阳性质粒命名为pAdGMCSFBZLF1。构建好的重组腺病毒载体经过测序鉴定，证明插入的序列正确无误。

　　1.7 重组腺病毒的制备

　　在25 cm2培养瓶中常规培养293细胞，当细胞生长至50%～70%融合时弃去培养基，按照脂质体转染试剂盒(lipofectamine 2000)使用说明书，将带有GMCSFBZLF1融合基因的重组腺病毒载体转染293细胞。在观察到细胞荧光出现5～7 d后收获细胞，反复冻融3次裂解细胞，离心除去细胞碎片，取上清再次接种293细胞，如此重复3～4 次。

　　1.8 RTPCR检测GMCSFBZLF1 mRNA

　　用重组腺病毒vAdGMCSFBZLF1感染293细胞，3 d后收集细胞，1 000 r/min 离心10 min，弃上清。采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，所获RNA加DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后进行RTPCR检测。作为对照，提取未感染重组腺病毒的293细胞RNA进行RTPCR，PCR产物于琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。

　　2 结 果

　　2.1 目的基因的RTPCR扩增

　　结果显示，人外周血淋巴细胞GMCSF和EBV阳性B958细胞BZLF1编码序列cDNA的PCR产物长度分别为470 bp和785 bp(图1)。序列分析示，GMCSF和BZLF1编码序列cDNA与GenBank中标准株相应序列一致。

　　2.2 融合基因PCR电泳和测序结果

　　融合基因GMCSFBZLF1的PCR扩增产物长度为1 210 bp。琼脂糖凝胶电泳显示，与DNA标准分子质量参照物DL 15 000比较，与预测结果一致(图2)，测序结果与GMCSF、BZLF1以及linker的核苷酸序列一致。

　　M：DL 2 000相对分子质量标准;①、②GMCSF基因PCR 产物(470 bp);③、④BZLF1 基因PCR 产物(785 bp);⑤阴性对照。

　　图1 目的基因的PCR扩增产物

　　M：DL 15000相对分子质量标准;①～⑥GMCSFBZLF1基因PCR产物;⑦阴性对照。

　　图2 融合基因GMCSFBZLF1的PCR扩增产物

　　2.3 腺病毒质粒穿梭载体pAdTrackCMVGMCSFBZLF1的鉴定

　　质粒TAGMCSFBZLF1经Bgl Ⅱ和EcoR Ⅴ双酶切后定向亚克隆入穿梭载体pAdTrackCMV，构建重组质粒pAdTrackCMVGMCSFBZLF1，提取质粒pAdTrackCMVGMCSFBZLF1行限制性核酸内切酶Bgl Ⅱ和EcoR Ⅴ双酶切分析，得到长1 210 bp的融合基因片段和约9 200 bp的片段(图3)。

　　2.4 融合基因GMCSFBZLF1真核表达载体的构建和鉴定

　　pAdTrackCMVGMCSFBZLF1与pAdEasy1质粒共转化感受态E. coli BJ5183发生同源重组获得pAdGMCSFBZLF1重组体，对pAdGMCSFBZLF1重组体测序分析表明，pAdGMCSFBZLF1真核表达载体构建成功，融合基因GMCSFBZLF1片段插入正确。重组腺病毒载体携带2个独立的CMV启动子表达盒，分别表达融合基因GMCSFBZLF1和GFP;转染48 h后即在荧光显微镜下观察到293细胞中GFP荧光，可间接反映融合基因的表达。随传代次数增加，重组腺病毒感染性稳定且增强，致细胞病变作用的时间缩短，通常传至4～5代时，在接种病毒后24～48 h，可观察到几乎所有细胞均出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vAdGMCSFBZLF1。提取重组腺病毒感染293细胞总RNA经RTPCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示特异性1 210 bp预计大小的片段(图4)，表明重组腺病毒在293细胞能有效转录。

　　3 讨 论

　　EBV相关肿瘤组织中EBV只存在于癌细胞而正常细胞阴性，使靶向基因治疗EBV相关肿瘤有可能通过EBV而实现。由于在EBV阳性的肿瘤细胞中，病毒通常以潜伏形式存在，并不影响宿主细胞的正常代谢，因此诱导其进入裂解期，进而特异性杀伤EBV阳性肿瘤细胞，有望成为治疗EBV相关肿瘤新的手段。

　　近年来许多研究结果表明，BZLF1表达可诱导病毒潜伏期活化进入裂解期，BZLF1编码蛋白为转录激活因子，可诱导潜伏状态的EBV进入裂解期复制[8]。孙淑红等[5]研究显示，携带外源性BZLF1基因的重组腺病毒能有效感染EBV阳性上皮细胞，进而诱导细胞潜伏期EBV进入裂解期进行复制，EBV增殖后经细胞膜释放最终可以特异性地杀伤EBV阳性肿瘤细胞。

　　细胞因子基因免疫是目前肿瘤基因治疗研究的热点，将具有抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使体内持续存在一定水平的内源性细胞因子以发挥抗肿瘤的作用。GMCSF是一种重要的免疫调节分子，它不仅可诱导在T细胞免疫反应中起关键作用的DC细胞成熟、分化，而且在免疫治疗过程中可增强主要和次要的抗体反应，以促进DC等APC分化、成熟和活化及上调CD86的表达水平，增强中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和ADCC效应等活性;促进Th、Tc、NK细胞在肿瘤部位浸润，抑制肿瘤细胞的生长。GMCSF强烈激活特异免疫反应这一突出作用可用于肿瘤治疗。NAKAMURA等[9]用腺病毒将表达于CT26细胞中的鼠内源性肿瘤抗原基因gp70和GMCSF转导入小鼠骨髓DCs, 由于GMCSF转入表达肿瘤相关抗原的DCs细胞，能够提高DCs细胞趋化因子CC亚族受体7的表达，而增强DC细胞迁移进入引流淋巴结的能力，从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答。QIU等[10]通过重组腺病毒将p53和GMCSF基因共转导入人喉癌Hep2细胞，发现可以有效诱导肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤特异性Tc细胞大量浸润并抑制Hep2细胞的增长。

　　已经有研究证实，将细胞因子基因GMCSF转入肿瘤细胞可使肿瘤细胞的免疫原性增强而致瘤性下降，从而提高诱导机体特异性的抗肿瘤免疫反应，但是该作用不够强大，对已发生的肿瘤治疗效果较差。为此，我们综合肿瘤基因治疗和细胞因子基因治疗的作用特点，将BZLF1基因和GMCSF基因融合后构建重组腺病毒表达载体，同时发挥BZLF1基因靶向杀伤EBV阳性癌细胞和GMCSF基因增强机体的抗肿瘤免疫作用。该融合基因载体可以在基因水平上对BZLF1和GMSCF基因拷贝数进行控制，精确控制两种功能性蛋白的比例，以达到最佳治疗效果，从而为探讨融合基因协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞的作用奠定实验基础。

　　本研究将GMSCF和BZLF1基因进行融合，成功构建了重组腺病毒表达载体。基因融合采用经典的重叠延伸PCR法，使用柔性连接子(linker)将GMCSF和BZLF1基因相连，简化了基因融合过程。而表达载体则采用当今广泛应用的AdEasy系统，该系统可在原核细胞E. coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，使得载体的构建程序快速而有效。

　　重组腺病毒表达载体经293细胞包装获得重组腺病毒vAdGMCSFBZLF1，RTPCR鉴定结果表明vAdGMCSFBZLF1重组腺病毒可在293细胞中有效转录。为进一步探讨该融合基因在EBV阳性肿瘤细胞的表达，同时发挥GMSCF基因增强抗肿瘤免疫和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用，进而协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞奠定了实验基础。

　　【参考文献】

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　　[9]NAKAMURA M, IWAHASHI M, NAKAMORI M, et al. Dendritic cells genetically engineered to simultaneously express endogenous tumor antigen and granulocyte macrophage colonystimulating factor elicit potent therapeutic antitumor immunity[J]. Clin Cancer Res, 2002,8(8):27422749.

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