即刻电针同神经节段经穴与非穴对痛经大鼠模型子宫IP3的影响

　　作者：丁喜艳,任晓暄,李春华,郭孟玮,赵雅芳,嵇波,朱江,张露芬 作者单位：北京中医药大学针灸学院,国家中医药管理局针灸特色疗法评价重点研究室,北京 100029;北京市丰台区新村社区卫生服务中心,北京 100070

　　【摘要】 　　目的 观察即刻电针同神经节段经穴与非穴对痛经大鼠模型子宫三磷酸肌醇(IP3)的影响。方法 50只雌性SD大鼠,随机分为盐水组、模型组及电针三阴交组、悬钟组、非穴组,每组10只。除盐水组外,其余各组大鼠均连续10 d给予皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,末次给药1 h后,腹腔注射缩宫素2 U/只,制造痛经大鼠模型,盐水组每日给予同等剂量的生理盐水。于第10日各组给予即刻电针20 min,盐水组及模型组束缚20 min,同时观察扭体反应,并采用酶联免疫法检测子宫IP3含量。结果 ①扭体反应：与盐水组比较,模型组每分钟扭体次数明显增多、每分钟扭体分数明显升高(均P<0.01);各电针组每分钟扭体次数明显增多(均P<0.01),每分钟扭体分数差异均无统计学意义(均P>0.05)。与模型组比较,各电针组每分钟扭体次数、扭体分数均明显降低(均P<0.01)。各电针组之间每分钟扭体次数、扭体分数差异均无统计学意义(均P>0.05)。②子宫IP3水平：与盐水组比较,三阴交组、模型组、悬钟组、非穴组均明显降低(P<0.05;P<0.01)。与模型组比较,三阴交组IP3含量明显升高(P<0.05);其他电针各组差异均无统计学意义(均P>0.05)。三阴交组子宫IP3明显高于悬钟组(P<0.01)。结论 即刻各电针组明显抑制了大鼠扭体反应,且电针各组在改善痛经症状中无明显差异,可能与同神经节段支配有关。三阴交组在对IP3的调节上与悬钟组有明显差异,体现了经穴效应特异性。

　　【关键词】 痛经;三磷酸肌醇;非穴;经穴效应特异性;即刻电针;大鼠

　　Effect on IP3 in Uterus Tissue of Dysmenorrhea Model Rats with Instant Electroacupuncture the Same Nerve Segment Acupoint and Non-acupuncture Point

　　DING Xi-yan, REN Xiao-xuan, LI Chun-hua, et al

　　(Acu-Moxibustion College of Beijing TCM University, Key Laboratory of Acu-Moxibustion, State Adminisitration of TCM, Beijing 100029, China;Xincun Community Health Service Center of Fengtai District, Beijing 100070, China)

　　Abstract：Objective To research the effect on IP3 in the uterus tissue of dysmenorrhea model rats with instant electroacupuncture (EA) the same nerve segment acupoint and non-acupuncture point. Methods Fifty femal SD rat were randomly divided into saline, model, EA “Sanyinjiao”(SP6), EA“Xuanzhong”(GB39), EA non-acupuncture point (NAP) groups with 10 rats in each group. Except for saline group, the rats were given subcutaneous injection of estradiol benzoate injection for 10 days. 1 h after the last administration, intraperitoneal injection of oxytocin 2 U was given to each rat to create dysmenorrhea model, saline group was given the same dose of saline per day. On the 10th day, each group of acupuncture was given EA 20 min, saline group and model group were bound 20 min, the writhing response was observed at the same time. The uterine IP3 content was detected with enzyme-linked immunosorbent assay method. Results ①Writhing response：Compared with the saline group, writhing numbers per minute and writhing scores per minute increased significantly in the model group (all P<0.01). Writhing numbers per minute increased significantly (all P<0.01), writhing scores per minute had no significant difference in the EA groups (all P>0.05). Compared with the model group, writhing numbers and writhing scores per minute decreased significantly in the EA groups (all P<0.01). Writhing numbers and writhing scores per minute had no significant difference among the EA groups (all P>0.05). ②IP3 content level of the uterus：Compared with the saline group, it was lower in SP6 group (P<0.05), and lower significantly in model, GB39 and NAP groups (all P<0.01). Compared with model group, SP6 group increased significantly (P<0.05), there was no significant difference in the other EA groups (P>0.05). The IP3 level in SP6 group was significantly higher than that in GB39 group (P<0.01). Conclusion Instant EA groups can inhibit the rats writhing response. EA groups had no significant differences in improving the dysmenorrhea symptoms, it may be related to the same nerve segment dominate. There was significant difference between SP6 and GB39 in regulating IP3, reflecting acupoint effect specificity.

　　Key words：dysmenorrhea;IP3;non-acupuncturev points;acupoint effect specificity;instant electroacupuncture;rats

　　大量研究数据表明,子宫平滑肌过度收缩是导致原发性痛经的重要原因[1]。三磷酸肌醇(IP3)是前列腺素F2α(PGF2α)引起子宫平滑肌收缩细胞信号转导途径的第二信使,IP3激活肌浆网上的IP3受体,引起细胞内外Ca2+水平的变化,从而导致平滑肌的收缩。本实验通过观察即刻电针同神经节段经穴与非穴对痛经大鼠模型子宫IP3的影响,进一步探讨针刺治疗原发性痛经在细胞信号转导方面的部分作用机制。现将实验结果报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　选用清洁级健康Sprague-Dawley(SD)品系雌性大鼠,3月龄,体重(240±20)g,性成熟未交配,北京维通利华实验动物技术有限责任公司提供,合格证号：SCXK(京)2006-0009。动物置于清洁柜中,实验室温度保持在(20±1)℃,湿度45%±5%左右。喂以大鼠普通饲料,自由饮水。在饲养过程中,对大鼠进行阴道筛查,选择动情间期的大鼠50只(具体方法见模型制备),纳入实验。分别编号、记录。

　　1.2 仪器

　　STAT FAX 2100全自动酶标仪(Awareness Technology Inc. USA);5810R型高速冷冻离心机(德国);三洋MDF-u50A型超低温冰箱(日本);汉医针灸针,规格0.17 mm×7 mm(天津杏林书院医疗器械有限公司),改良后使用;LH202H型韩氏穴位神经刺激仪(北京华卫产业开发公司)。

　　1.3 药物和试剂

　　苯甲酸雌二醇注射液,上海通用药液股份有限公司生产,批号040304;缩宫素注射液,上海禾丰制药厂生产,批号070709;IP3试剂盒(Adlitteram Diagnostic Laboratories, Inc USA)。

　　1.4 分组

　　采用阴道涂片法[2],每日定时用细棉签以生理盐水湿润后轻轻插入实验大鼠阴道约0.5 cm,慢慢转动一下取出,将带有阴道内含物的细棉签在载玻片上均匀转动涂片,在空气中干燥,然后在显微镜下观察阴道涂片的组织学变化,根据细胞形态、种类及数量筛选动情间期3月龄SD雌性大鼠50只,按照随机数字法分为盐水组、模型组、电针三阴交组、电针悬钟组、电针非穴组,每组10只。

　　1.5 造模

　　痛经大鼠模型依据文献[3]方法并加以改进。动情间期大鼠除盐水组外,其余各组大鼠均每日给予大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,连续10 d,第1日及第10日每日注射0.5 mg/只,第2-9日每日0.2 mg/只,末次给药后1 h,腹腔注射缩宫素2 U/只。盐水组每日给予同等剂量的生理盐水。

　　1.6 电针方法

　　穴位：参照文献[4]定位。“三阴交”位于后肢内踝尖上10 mm,“悬钟”根据大鼠形态、解剖、生理特点,将其定位于后肢外踝尖上10 mm,腓骨前缘;“非穴”选取与悬钟穴水平,位于胆经与胃经中点处。

　　方法：注射缩宫素后,以自制布袋固定大鼠,根据不同分组,予针刺治疗。悬钟、三阴交、非穴均直刺3～5 mm,并在相应穴位向心端旁开约1 mm处再针入一针,针刺入皮肤即可,两针间放一棉球,以防短路,胶布固定后连接韩氏穴位神经刺激仪,同侧肢体相同导联,频率2/100 Hz交替,强度0.1～0.3 mA,疏密波,留针20 min。盐水组、模型对照组以相同方法固定20 min,但不做电针处理。

　　1.7 检测指标

　　观察注射缩宫素后大鼠每分钟扭体反应,根据Schmauss提出的行为学评分标准[5],将扭体行为分为4个等级。0级：正常姿势(手爪平放盒底或正常探查行为);1级：身体向左或右偏斜;2级：后肢伸展,后爪背屈,躯体伸展伴频繁地盆骨侧向旋转;3级：腹部肌肉收缩,伴躯体伸展和后肢伸展。记录20 min内平均每分钟扭体次数并评价每分钟扭体分数。

　　每分钟行为学分数=[0级(次数)×0(分)+1级(次数)×1(分)+2级(次数)×2(分)+3级(次数)×3(分)]/20

　　检测子宫IP3含量：大鼠扭体反应后,即刻快速断头,冰上迅速摘取子宫,5%的高氯酸匀浆后,4 ℃、3 500 r/min离心20 min,取上清,严格按试剂盒说明书操作程序,采用酶联免疫法进行检测。

　　1.8 统计学方法

　　所有数据以—(—数)±s表示。应用统计软件包进行统计学处理,各组组间差异采用方差分析,继以LSD检验;扭体反应与IP3的关系采用Spearman相关分析。

　　2 结果(见表1～表3)表1 各组大鼠扭体反应的比较，表2 各组大鼠子宫IP3水平比较，表3 大鼠子宫IP3与每分钟扭体次数、每分钟扭体分数的Spearman相关分析(略)

　　3 讨论

　　子宫合成和释放PGF2α增加,刺激子宫过度收缩,是原发性痛经的重要原因[6]。平滑肌收缩与细胞内游离Ca2+浓度密切相关,IP3是促进细胞内钙释放的重要第二信使[7],PGF2α与其相应受体结合后,通过G蛋白激活磷脂酶C(PLC),后者水解磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-phosphate,PIP2)生成IP3和甘油二酯(diacylglycerol,DAG),IP3与肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)上的受体结合后,开放离子通道,使肌浆网内的钙释放,细胞内Ca2+浓度升高[8],Ca2+与钙调蛋白(camodulin, CaM)结合后,激活肌球蛋白轻链激酶(MLCK),后者使肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)上丝氨酸-19磷酸化,肌球蛋白ATP酶(ATP酶)活性增加,肌丝滑行,平滑肌收缩[9]。

　　本实验结果显示,模型组每分钟扭体次数极明显增多、每分钟扭体分数明显升高,表明模型制备较为成功。电针各组可明显改善痛经模型大鼠扭体反应,取得满意的治疗效果。但各电针组之间在改善扭体反应及对子宫IP3的调节并未表现出经穴的特异性。

　　由IP3与扭体反应的相关分析可见,大鼠子宫IP3与每分钟扭体次数、每分钟扭体分数均呈负相关关系,可以推测,模型组大鼠子宫与受体结合的IP3较多,从而激活平滑肌收缩细胞信号转导的级联反应,导致平滑肌收缩而引起明显的扭体反应,因此,用酶联免疫法所测的子宫中IP3降低。

　　本实验电针各组可明显改善扭体反应,其中三阴交组子宫IP3较模型组明显升高,故与受体结合的IP3较模型组少,从而抑制了子宫平滑肌收缩。悬钟组及非穴组子宫IP3与模型组比较差异无统计学意义,两穴改善大鼠扭体反应可能与以下原因有关：①由于平滑肌收缩细胞信号转导通路较复杂,其中心环节是CaM与Ca2+结合后,能激活MLCK,活化的MLCK则能使MLC磷酸化[10]。另外,CaM也能与Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)结合,使后者活化,活化的CaMKⅡ能使MLCK磷酸化,负性调节MLCK的功能,使平滑肌对Ca2+的敏感性下降[11],IP3介导的[Ca2+]i浓度升高,可以失活IP3敏感的通道,直接抑制钙的释放,也可以激活钙敏感的钾通道,超极化细胞膜,间接抑制降低钙的释放。这些交互关系或负反馈机制,使细胞内的钙离子浓度保持在一个相对稳定的水平[12]。可见,IP3在电针组和模型组中发挥了不同的生物效应,即虽然电针悬钟组、非穴组和模型组IP3都与受体结合,但模型组激活了受体后信号转导通路,而悬钟组、非穴组却通过受体后抑制及负性调节而阻止了信号级联反应的发生,从而使扭体反应明显改善。②在平滑肌收缩活动中,MLCK对MLC的钙依赖性磷酸化是引起平滑肌收缩的主要原因,同时还存在着其它非钙依赖性的调节途径。如Rho-kinase、花生四烯酸及蛋白激酶C(PKC)等都能抑制肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的活性,减少MLC的脱磷酸化。从而维持平滑肌的张力[13]。模型组在激活钙依赖途径的同时,有可能通过非钙依赖性的调节途径增强了子宫的收缩力,而电针各组并没有激活非钙依赖性的调节途径。③扭体反应是一种内脏痛模型,广泛用于检测中枢和外周镇痛效应[14],各电针组在影响平滑肌收缩信号转导通路的同时并不能排除对镇痛物质的调节。

　　中医学认为,痛经的病因多为肾精亏少、肝气郁滞、脾失健运、外感寒热之邪等,而主要病机在于邪气内伏或精血素亏,更值经期前后冲任二脉气血的生理变化急骤,导致胞宫的气血运行不畅,“不通则痛”;或胞宫失于濡养,“不荣则痛”,故痛经发作[15]。三阴交穴是足三阴经交会处,具有调节足三阴经气血的功能,其主要功能补肾健脾、益气养血、疏肝理气、祛瘀通络。用于治疗痛经,切中病机。悬钟穴为足少阳胆经经穴,为八会穴之髓会,有填精益髓、舒筋活络、清热通便、理气止痛的功能。因以往的研究鲜见其治疗痛经的报道,故将其作为非相关穴进行对照观察。从研究结果看,悬钟也取得了较好的疗效,与其调节枢机功能密不可分,为痛经从肝胆经论治提供了探索的空间。非穴组与穴位组取得同样的效应,与刘氏等[16]的研究结果一致。

　　支配大鼠三阴交的神经纤维来自L3-6神经,支配悬钟的神经纤维来自L4-6神经[17],非穴位于悬钟水平旁,与三阴交、悬钟处于同神经节段。支配子宫的交感神经主要来自T10-S2节段[18],副交感神经来自L6-S1神经节段[19]。有研究表明,即时效应是通过神经反射来实现的[20]。电针经穴与非穴可能同时通过神经反射抑制了子宫的交感及副交感神经,而缓解子宫的收缩。另外,电针经穴与非穴均能激活痛负反馈调制的脊髓上中枢中缝大核(NRM),从而产生镇痛作用[16]。因此,针刺各组之间在改善扭体反应中并未表现出经穴的特异性。但即刻三阴交穴对子宫IP3产生了一定的调节作用,且较悬钟组IP3明显升高,因此在神经反射的同时,产生了一定的经穴效应差异,体现了经穴-脏腑的相关性。

　　综上所述,即刻电针经穴、非穴均可明显改善大鼠痛经症状,即刻三阴交组通过减少IP3与受体的结合,在一定程度上抑制了子宫平滑肌收缩信号转导途径,即刻悬钟组、非穴组可能通过IP3受体后抑制及负性调节机制影响了子宫平滑肌收缩的细胞信号转导途径。但电针各组在改善扭体反应中并未表现出经穴的特异性,可能与同神经节段支配即时效应有关。即刻三阴交组与悬钟组在对IP3的调节中有明显的效应差异,各针刺组对IP3受体后通路、平滑肌收缩的非钙依赖性调节途径及镇痛物质的调节还有待于进一步深入研究。

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