丹酚酸B盐抗腹主动脉不完全结扎大鼠心肌纤维化的实验研究

　　【摘要】 　　目的 探讨丹酚酸B盐(SA-B)对腹主动脉结扎大鼠心肌神经内分泌因子及间质性胶原沉积的影响。方法 腹主动脉不完全结扎法制备大鼠心肌肥厚模型。大鼠随机分为假手术组、模型组,丹酚酸B盐低、中、高剂量组和卡托普利组,各药物组均采用灌胃给药。测量大鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP),称重法测定心脏指数(HW/BW、LVW/BW);放免法测定心肌血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血清醛固酮(ALD)含量,消化法测定心肌羟脯氨酸(Hyp)含量,免疫印迹法观察心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平。结果 模型组SBP、DBP、HW/BW、LVW/BW、AngⅡ、ALD、Hyp及Ⅰ、Ⅲ型胶原含量升高,心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达明显增加。SA-B各用药组能改善心肌肥厚指数,降低AngⅡ及Hyp水平和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达,以中、高剂量组作用更为显著。结论 SA-B能通过降低压力负荷性心肌肥厚大鼠肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性而抑制心肌间质性纤维化的形成。

　　【关键词】 丹酚酸B盐;心室重构;肾素-血管紧张素-醛固酮系统;间质性胶原;羟脯氨酸;大鼠

　　Influence of Salviandic Acid B on Cardiac Fibrosis in Left Ventricle Tissue of Cardiac Hypertrophy Induced by Abdominal Aortic Banding in Rats

　　CUI Hong-yan, PENG Yuan, WU Qi, et al

　　(Department of Pharmacology, Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China;Shuguang Hospital Attached to Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China)

　　Abstract：Objective To evaluate the influence of Salviandic acid B (SA-B) on some neurohormonal factors and interstitial collagen in ventricular remodeling induced by abdominal aortic banding (AAB) in rats. Method Ventricular remodeling model was induced by AAB in rats. Rats were randomly divided into 6 groups：normal, model, SA-B high, SA-B middle, SA-B low and Captopril control group. The drug groups used gavage method. The systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP) were measured, the ratios of LVW/BW (1eft ventricle weight/body weight), HW/BW (heart weight/body weight) were calculated, the Angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) in heart tissue and Aldosterone (ALD) concentration of plasma were checked by radioimmunoassay, hydroxy proline (Hyp) content in heart tissue was measured by hydrolysis method, the level of type Ⅰ and Ⅲ collagen in myocardium were determined by western blotting. Result SA-B could decrease the cardiac indexes of LVW/BW and HW/BW, significantly reduce the content of Ang Ⅱ activity, significantly down-regulate Hyp content and the level of type Ⅰ and Ⅲ collagen in myocardium. Conclusion SA-B can inhibit heart interstitial fibrosis in experimental ventricular remodeling by inhibiting Ang Ⅱ activity.

　　Key words：Salviandic acid B;ventricular remodeling;renin-angiotensin-aldosterone system;interstitial collagen;hydroxyproline;rats

　　无论何种原因引起心肌损害,只要病变持续和病程慢性化,最终将导致心肌纤维化。心肌纤维化主要表现为心脏实质细胞的损害和间质细胞主要是成纤维细胞的增殖活化,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成超过降解,纤维性胶原尤其是间质性胶原(主要为Ⅰ型和Ⅲ型胶原)不成比例地增多并且在心脏间质内大量增生与过度沉积[1]。心肌的进行性纤维化伴随着心脏间质胶原网络的重构和心脏功能的减退,是各种心脏病导致晚期心功能衰竭的共同途径和病理基础。

　　目前认为,神经内分泌因子的激活在心肌纤维化过程中起到重要作用[2],其中血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是一个核心因子。AngⅡ与其受体AT1结合,激活某些信号转导通路,最终导致心肌成纤维细胞增殖与活化,心肌纤维化,心室重构形成。因此,寻找能够抑制AngⅡ过度表达及其信号转导的药物对积极防治心肌纤维化具有重要意义。

　　丹参为传统的活血化瘀中药,其水溶性成分“丹参多酚酸盐”已正式批准为临床治疗冠心病心绞痛的新药。丹酚酸B盐(salvianolic acid B,SA-B)是丹参多酚酸盐的主要成分,现已证实其具有良好的抗肝、肾纤维化作用[3-4],但其对心室重构、心肌纤维化的作用目前尚未见报道。因此,笔者选用腹主动脉不完全结扎大鼠心肌纤维化模型,应用SA-B进行干预,观察其对AngⅡ及间质性胶原表达的作用。

　　1 实验材料

　　1.1 动物

　　SD大鼠,雄性,体重220～250 g,购自中国科学院上海实验动物中心,许可证号：SCXK(沪)-2003-0002,饲养于上海中医药大学实验动物中心,自由饮食及饮水。

　　1.2 药物

　　SA-B盐由中国科学院上海药物研究所从上海崇明人工栽培的丹参中分离、提取、鉴定,纯度为80%,分子量为718,分子式C36H30O16,上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所馈赠。卡托普利片,批号080203,上海衡山药业有限公司生产。

　　1.3 试剂

　　AngⅡ放免试剂盒,批号20080530,购自北京普尔伟业生物科技有限公司;醛固酮(ALD)放免试剂盒,批号080520,购自北京北方生物技术研究所;羟脯氨酸(Hyp)试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物技术研究所。小鼠抗Ⅰ、Ⅲ型胶原单克隆抗体,Abcam公司产品。辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体,Chemicon 公司产品。

　　2 实验方法

　　2.1 造模

　　制备腹主动脉不完全结扎大鼠模型。取220～250 g的雄性SD大鼠75只,手术前12 h禁食不禁水,2%戊巴比妥钠按35 mg/kg体重腹腔注射麻醉,待角膜反射消失后仰卧固定于手术台,腹部正中剑突下切开皮肤2～3 cm,于左肾动脉上方不完全结扎腹主动脉,使外径缩小为0.7 mm,缝合腹壁,注射3 d抗生素,防止手术感染。假手术组动物开腹后仅分离腹主动脉但不结扎,其余步骤与造模动物相同。

　　2.2 分组与给药

　　将造模动物分为模型组,SA-B低、中、高剂量组和卡托普利组。SA-B低、中、高剂量组给药剂量分别为10、20、40 mg/(kg·d),卡托普利组为40 mg/(kg·d)。自造模后第3日各给药组灌胃给药,模型组和假手术组灌服同容积饮用水,连续35 d。

　　2.3 观测项目

　　2.3.1 大鼠血压的测定

　　麻醉大鼠后分离左颈动脉,插入注有50 U/mL肝素钠溶液的PE-50聚乙烯导管,通过压力换能器测定大鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP)的变化。

　　2.3.2 大鼠心脏指数的测定

　　大鼠称体重,插管后腹主动脉取血。迅速打开胸腔取心脏,用滤纸吸干水分,冰上剪除心房组织,沿室壁剪开,分离左、右心室并分别准确称重。计算全心重量/体重(HW/BW)指数、左心室重量/体重(LVW/BW)指数。

　　2.3.3 血清醛固酮含量测定

　　采用放射免疫法。具体操作方法见试剂盒说明书。

　　2.3.4 心肌组织血管紧张素Ⅱ含量测定

　　采用放射免疫法。取大鼠左心室中部心肌组织约200 mg,加入2 mL生理盐水,冰浴匀浆,3 500 r/min离心10 min,制备成2%的心肌组织匀浆,按试剂盒说明书操作测定AngⅡ含量,同时进行蛋白测定。结果以每毫克蛋白中的AngⅡ含量表示。

　　2.3.5 羟脯氨酸含量测定

　　采用消化法。具体操作方法见试剂盒说明。

　　2.3.6 左心室心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量测定

　　采用免疫印迹法。提取心室肌组织总蛋白,取30 ?g总蛋白进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(注：蛋白未变性)。电转移至硝酸纤维素膜上,脂奶粉封闭,分别与特异性抗小鼠抗体进行孵育(Ⅰ型胶原1∶1500、Ⅲ型胶原1∶200),充分洗涤后孵育辣根过氧化物酶偶联抗小鼠抗体,ECL电化学发光,X线摄片。采用计算机进行图像扫描分析,测定灰度值,代表蛋白表达量。将同一张蛋白印迹膜曝光后,用0.5%SDS洗脱抗体,再用GAPDH进行孵育杂交以作为内参照。

　　3 统计学方法

　　计量资料以—(—资)±s表示,采用多组间方差分析,组间两两比较采用q检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

　　4 结果(见表1～表3、图1)

　　表1 SA-B对腹主动脉不完全结扎大鼠血压的影响(略)

　　表2 SA-B对腹主动脉不完全结扎大鼠心脏指数的影响(略)

　　表3 SA-B对腹主动脉不完全结扎大鼠血清ALD、心肌AngⅡ和Hyp含量的影响(略)

　　5 讨论

　　心室重构、心肌纤维化包括心脏实质重建和间质重建。后者主要表现为心肌间质细胞的活化及细胞外基质的过度沉积。心肌ECM由纤维胶原、基底膜蛋白、蛋白聚糖等组成,对维持左室结构、心肌细胞的排列和协调心肌收缩性起重要作用。在心脏,Ⅰ型和Ⅲ型胶原是ECM的主要成分。适当比例的Ⅰ型和Ⅲ型胶原交联排列形成心脏的支架,维持心肌细胞和间质细胞的正常结构,对心脏的舒缩功能和心室的顺应性具有非常重要的意义。正常情况下,ECM的代谢维持着一个动态的平衡,一旦这种平衡被破坏,ECM生成增多或降解下降,均可使胶原过度沉积,导致心肌纤维化的发生[5]。心肌间质中基质胶原的增加,以及胶原类型、组分、相互连接的改变是心室重构的重要组成部分,是导致心室舒张功能障碍的主要原因。本实验结果显示,部分结扎腹主动脉可使大鼠Hyp和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达明显升高,表明压力超负荷引起心肌间质胶原增殖和纤维化。SA-B各剂量及阳性对照药能明显降低Hyp和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平,表明SA-B可通过抑制心肌间质纤维化而改善心肌肥厚与重构过程。

　　肾素-血管紧张素-醛固酮(Renin-angiotensin Aldosterone system,RAAS)系统是调节心血管生理功能的重要体液系统, AngⅡ是这一系统关键的活性产物,在多种心血管疾病的病因学及发病过程中有重要作用,与心脏肥大和心力衰竭的病理生理过程密切相关。心室重构、心肌纤维化形成过程中RAAS过度激活,可引起AngⅡ和ALD的过度表达。AngⅡ对心脏的作用通过多个环节产生,如：影响中枢神经系统功能、刺激交感神经释放递质、刺激醛固酮合成与释放、增加肾脏对Na+的重吸收、收缩血管,以及兴奋交感神经后引起心率加快等。AngⅡ引起心肌纤维化的主要细胞分子机制是AngⅡ与其受体AT1结合,激活几条与细胞生长有关的信号转导通路,启动转录,诱导相关基因表达,使核酸和蛋白质合成增加,最终导致成心肌纤维细胞增殖与活化,胶原合成增加,心肌纤维化形成[6]。本实验采用腹主动脉不完全结扎制备心肌纤维化模型,此模型动物在手术后血压明显升高,3 d后血浆RAAS即已激活,造模2周左右即可出现心肌纤维化,后期突出表现为广泛的间质性纤维化。腹主动脉缩窄30 d造成的压力超负荷大鼠心肌肥厚模型是向心性肥厚,表现为室壁增厚而室腔容积减少、心脏/体重比值增大、心肌细胞肥大、心肌纤维排列紊乱,心室的收缩功能尚处于代偿阶段。本实验结果也表明,模型组大鼠血压、心肌组织AngⅡ和血清ALD含量均明显升高,SA-B用药组能明显降低心肌组织AngⅡ水平,也使血清ALD含量有下降的趋势。提示SA-B可通过抑制RAAS的活性而抑制心室重构、心肌纤维化的形成。

　　【参考文献】

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　　[2] Kurosawa Y, Katoh M, Doi H, et a1. Tissue angiotensin-converting enzyme activity plays an important role in pressure over-load induced cardiac fibrosis in mts[J]. J Cardiovase Pharmacol,2002, 39(4)：600-609.

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　　[4] 王清兰,袁继丽,陶艳艳,等.丹酚酸B对HgCl2中毒大鼠肾间质纤维化的作用[J].中药药理与临床,2008,24(1)：12-15.

　　[5] Chapman D, Eghbali M, Eghbali M, et a1. Regulation of fibrillar collagen types I and Ⅲ and basement membrane typeⅢ collagen expression in pressure overload rat myocardium[J]. Cite Res,1990, 67(4)：787-794.

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