逍遥散对内脏高敏感大鼠血浆及结肠黏膜鸟苷素表达的干预作用

　　【摘要】 目的：观察逍遥散对内脏高敏感肠易激综合征(IBS)大鼠血浆及结肠黏膜鸟苷素表达的干预作用。方法：70只SD大鼠随机分为正常组20只和实验组50只，实验组采用慢性束缚+夹尾刺激作为复合应激原复制IBS大鼠模型。造模第28天，正常组、实验组各随机抽取10只大鼠处死，检测结肠黏膜病理。实验组再随机分为模型组、匹维溴胺组、逍遥散高、中、低剂量组，各8只。检测各组大鼠血浆、结肠黏膜鸟苷素的表达水平及内脏敏感性变化。结果：模型组大鼠结肠分泌增加，结肠运动增强，内脏敏感性增高，血浆、结肠黏膜鸟苷素表达水平增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。逍遥散能提高大鼠腹部收缩反射最小容量阈值(P<0.05)，降低血浆、结肠黏膜鸟苷素含量，降低结肠运动(P<0.05，P<0.01)。结论：IBS大鼠血浆、结肠黏膜鸟苷素表达与结肠运动功能障碍、内脏敏感性异常有一定的相关性，逍遥散可降低内脏高敏感IBS大鼠结肠分泌与运动，其机制可能与降低血浆、结肠黏膜鸟苷素的表达水平，调节其肠道运动障碍有关。

　　【关键词】 大鼠 肠易激综合征 内脏高敏感性 鸟苷素 逍遥散

　　Effect of Xiaoyaosan on Guanylin Levels in Serum and Colon Mucosa of Stressed Rats with Irritable Bowel Syndrome

　　SHI Junjie.

　　Zhejiang University of Chinese Medicine,Hangzhou 310053,China

　　Abstract Objective:To observe the effect of Xiaoyaosan on the visceral hypersensitivity of stressed rats with irritable bowel syndrome(IBS) and to explore the underlying mechamism. Methods:IBS was induced by chonic bandagedstress and inserting the end.All rats were randomly divided into 6 groups:the normal control group(10 rats),the model group,the positive control group,and the low,medium,and highdosage of Xiaoyaosan groups,8 in each.The visceral hypersensitivity and the content of Cor in serum were determined and compared in all groups.Results:Compared with the normal control group,the visceral sensitivity and the content of Cor were increased in the model group (P<0.05,P<0.01),but they were decreased in 3 Xiaoyaosan groups(P<0.05，P<0.01).Conclusion:Xiaoyaosan can reduce the visceral sensitivity of stressed IBS rats by decreasing the Cor level in the serum and colon mucosa.

　　Key words rats irritable bowel syndrome visceral sensitivity guanylin Xiaoyaosan

　　肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是临床常见的功能性胃肠病，其临床表现以腹痛、腹胀伴排便习惯的改变(腹泻、便秘或腹泻便秘交替)为主。目前研究表明，其发病是在多种因素的综合作用下，最终导致肠道运动功能障碍和内脏感觉异常。鸟苷素(guanylin)是鸟苷素家族的主要成员之一，与腹泻的发生密切相关[1]。然而，鸟苷素在IBS发病机制中的作用尚不完全清楚。本实验通过慢性束缚+夹尾刺激复制内脏高敏感IBS大鼠模型，观察IBS模型大鼠血浆、结肠黏膜鸟苷素的表达与内脏高敏感的相关性及逍遥散的干预作用。现报道如下。

　　1 实验材料

　　1.1 动物

　　同批清洁级雄性SD大鼠70只，体重(200±10)g，购自浙江中医药大学实验动物中心。动物合格证书号：SYXK(浙)20080115。实验前动物适应环境1周，自由饮水、进食。

　　1.2 药物

　　逍遥散(柴胡、白芍、茯苓、白术各9g，薄荷、生姜、甘草各4.5g)，中药材由浙江省中医院提供。中药煎煮2次后，合并2次滤液，浓缩为含生药量1g/ml的药液。匹维溴胺(法国苏威制药，批号:20060508)，用蒸馏水配制成1mg/ml的混悬液。

　　1.3 试剂及仪器

　　鸟苷素试剂盒(北京北方生物技术研究所提供，批号:200704)。8F导尿管，导管直径2mm,球囊最大容量3ml，最大直径2cm，用作直肠内球囊扩张导管(浙江康康医疗器械有限公司)，OlympusCH2光学显微镜(日本欧林巴斯光学工业株氏会社)。

　　2 实验方法

　　2.1 造模

　　70只大鼠按简单随机化原则，先分成正常组(20只)和实验组(50只)。实验组以慢性束缚+夹尾刺激法复制IBS大鼠模型[2]。大鼠每5只同笼，用裹有海绵的夹子夹大鼠尾巴近端1/3处，注意不损伤皮肤，使其激怒，寻衅与其他大鼠撕打，从而激怒全笼大鼠打斗，刺激时间持续30min。夹尾刺激结束1小时后，大鼠予30%水合氯醛(3ml/kg)麻醉，用布带束缚前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部，但不控制其活动。自大鼠清醒后开始计时，束缚时间为2小时。束缚+夹尾刺激共2周，刺激结束后2周内不进行任何实验操作。正常组大鼠不予任何刺激。造模第28天，正常组、实验组各随机抽取10只大鼠处死，检测大鼠结肠黏膜病理学改变。

　　2.2 分组与给药

　　造模成功后的实验组大鼠再按随机化原则分为模型组、匹维溴胺组和逍遥散高、中、低剂量组，每组8只。于第5周起各组大鼠分别灌胃给药，实验药剂量按照实验动物研究“等效剂量”的计算方法。逍遥散低、中、高剂量组给药量分别为5、10、20g/(kg·d)，匹维溴胺组给药量为15mg/(kg·d)，正常组、模型组灌服等量生理盐水作为安慰对照，1天1次。为消除生物节律影响，均于上午8时开始灌胃。连续给药4周，至第8周结束。

　　2.3 指标检测

　　2.3.1 结肠黏膜病理学观察

　　实验第28天，正常组、实验组各随机取10只大鼠处死，剖取乙状结肠0.5cm，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察大鼠结肠黏膜病理组织学改变。

　　2.3.2 结肠转运功能

　　大鼠实验前24小时禁食，予30%水合氯醛(3ml/kg)麻醉，取直径为3mm的玻璃小球放入距肛门3cm的直肠内。大鼠苏醒后迅速移至笼内喂食饮水，笼内垫清洁滤纸。观察束缚2小时内大鼠排便的粪点数和直肠内玻璃小球排出时间。

　　2.3.3 内脏敏感性评估

　　以球囊结直肠扩张(CRD)引起腹部收缩反射(AWR)的最小容量阈值反映其内脏敏感性。大鼠水合氯醛麻醉下，导尿管石蜡油润滑后经肛门插入，球囊末端距离肛门1cm，用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起，固定气囊。大鼠苏醒后，放在特制的透明塑料笼(18cm×5cm×7cm)中，大鼠在笼中只能前后运动，不能转身。30min适应期后经导尿管外口向球囊内注入26℃～28℃生理盐水扩张肠道，记录引起大鼠腹部收缩反射的最小注水量，即最小容量阈值。重复扩张3次，每次扩张间隔30min，数据取均值。

　　2.3.4 血浆、结肠黏膜鸟苷素测定

　　给药结束后第2天，各组大鼠眼球取血，为消除生理节律影响，均于上午8时开始操作。血液置于离心管中(试管预冷，内含0.5MEDTA 30μl和抑肽酶1500KIU)，离心10min(1500r/min),分离血浆。各组大鼠处死，剖取部分结肠组织，加入1%乙酸5ml，煮沸10min，匀浆后离心10min(3000r/min),取上清液。采用双抗体分离法测定血浆、结肠组织鸟苷素含量。

　　2.4 统计学方法

　　采用SPSS10.0版统计软件，计量数据以(±s)表示，采用单因素方差分析，显著性水准为P<0.05。

　　3 实验结果

　　3.1 结肠黏膜病理组织学改变

　　肉眼观察实验组大鼠结肠黏膜无充血、水肿、溃疡，光学显微镜下观察无弥漫性炎症细胞浸润等组织学改变。

　　3.2 各组大鼠结肠转运功能比较

　　与正常组比较，模型组大鼠结肠转运加速，排便量增多，直肠内玻璃小球排出时间缩短(P<0.01);各治疗组结肠转运功能较模型组均有显著改善(P均<0.05)，见表1。表1 各组结肠转运功能比较(略)

　　3.3 各组大鼠腹部收缩反射(AWR)最小容量阈值比较

　　与正常组比较，模型组大鼠球囊结直肠扩张引起腹部收缩反射的最小容量阈值明显降低，差异有统计学意义(P<0.01);各治疗组腹部收缩反射的最小容量阈值均明显高于模型组(P均<0.05)，见表2。表2 各组AWR最小容量阈值比较(略)

　　3.4 各组大鼠血浆、结肠黏膜鸟苷素水平比较

　　模型组大鼠血浆、结肠黏膜中鸟苷素含量较正常组明显增高(P均<0.01);各治疗组大鼠血浆及结肠黏膜鸟苷素含量显著低于模型组(P<0.05,P<0.01)，见表3。 表3 各组血浆、结肠黏膜鸟苷素水平比较(略)

　　4 讨论

　　IBS是功能性胃肠病的一个典型代表。近年来，关于IBS的发病机制研究，有学者认为IBS是一种应激障碍，内脏敏感性增高是其重要的病理生理特征，是其症状产生的重要基础和症状多样化的原因。通过动物实验建立的内脏高敏感模型能够较好地模拟IBS患者的某些临床特征，有助于研究IBS的病理生理机制。本实验以慢性束缚+夹尾刺激作为复合应激原诱导IBS大鼠模型，结果表明，模型大鼠结肠转运效应明显增加(P<0.01)，结肠黏膜病理学观察无明显组织学改变，同时用引起大鼠腹部收缩反射的最小容量阈值评价大鼠对直肠扩张刺激的敏感性;结果还表明慢性束缚+夹尾刺激后大鼠对肠道机械性刺激的反应强烈，提示其内脏敏感性增加(P<0.01)，符合IBS的发病特征。

　　鸟苷素是1种由15个氨基酸组成的肽，是强大的内源性大肠杆菌热稳定肠毒素(Sta)受体激活物，大鼠结肠和小肠均有鸟苷素mRNA的表达。鸟苷素是主要的内源性促动力物质之一。鸟苷素与其受体鸟苷素环化酶C(GCC)结合，激活鸟苷酸环化酶，使细胞中cGMP升高，激活氯离子通道，促进肠内水及电解质的迅速分泌，肠内容物增加;同时促进肌膜Ca2+摄入及肌浆网释放Ca2+，使肌浆内Ca2+浓度增加，肌细胞收缩加强[3,4]。本实验结果显示，慢性束缚+夹尾刺激诱导的IBS大鼠血浆和结肠组织中的鸟苷素表达增加，有利于鸟苷素与肠特异性受体结合，激活鸟苷素环化酶，提高平滑肌细胞内的cGMP水平，增加平滑肌细胞内Ca2+的浓度，促进结肠平滑肌的收缩运动。

　　IBS归属中医“肠郁”、“泄泻”、“腹痛”、“便秘”范畴，主要病机是情志失调导致肝木乘脾，肝脾失调，如叶桂云“肝病必犯土，克脾则腹胀，便或溏或不爽”，治疗重点在于疏肝健脾。逍遥散是中医治疗应激所致疾病的经典名方。研究表明，逍遥散对心理社会因素所致的应激性机体功能失调具有较好的调节作用;能增加慢性束缚应激大鼠脑内NE、DA神经递质的水平，拮抗免疫抑制，抑制HPA轴兴奋性;对抗小肠功能的亢进，恢复肠道平滑肌的收缩节律[5]。中医治疗IBS立足于整体调节，重视情志致病，具有多层次、多靶点的整体良性调节作用和理法方药的灵活性等特点。本实验结果表明，逍遥散可改善结肠的分泌和转运功能，使IBS大鼠增高的内脏敏感性降低，降低血浆、结肠黏膜鸟苷素的表达水平(P<0.05,P<0.01)，推测逍遥散治疗IBS的作用机制可能与调节鸟苷素的表达水平，促进结肠平滑肌的收缩运动，恢复肠道平滑肌的收缩节律，从而提高内脏痛阈，降低内脏高敏感性有关。

　　【参考文献】

　　[1] Forte LR，Eber SL，Fan X，Lymphoguanylin: cloning and characterization of a unique member of the guanylin peptide family[J].Endocrinology，1999,140(4):18001806.

　　[2] 石君杰，戴玉英，王海云，等.慢性束缚及夹尾刺激致大鼠肠易激综合征模型的建立及其内脏敏感性评价[J].中国中西医结合消化杂志，2008，16(2)：8790.

　　[3] Mitchell BJ，Hawkin H，David PW.GuanylinmRNA expression in human intestine and colorectal adenocarcinoma[J].Lab Inves，1998,78(2):101108.

　　[4] 侯晓华.消化道运动学[M].北京：科学出版社，1998.125180.

　　[5] 乔明琦，张惠云.中医情志学[M].北京：人民卫生出版社，2009.360380.