防己黄芪汤对LPS作用下大鼠肝星状细胞增殖的影响

　　【摘要】 目的：观察防己黄芪汤对内毒素脂多糖(LPS)作用下大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的影响。方法：将大鼠TSCT6细胞株置DMEM中，37℃5%CO2条件下培养传代后分为空白组、内毒素脂多糖组、防己黄芪汤大、中、小剂量组。除空白组外，其他各组培养液中均加入终浓度1EIU/ml LPS，防己黄芪汤大、中、小剂量组终浓度分别为10、5、2.5mg生药/mL。连续5天以MTT法检测HSCT6的吸光度变化;采用ELISA法检测培养48小时后HSCT6 的TIMP1、MMP2和TGFβ1的水平。结果：与LPS组比较，防己黄芪汤能明显促进MMP2分泌，抑制TIMP1、TGFβ1分泌，有效抑制大鼠HSCT6增殖，大剂量防己黄芪汤抑制作用尤为明显(P<0.01)。结论：防己黄芪汤能有效抑制大鼠HSC增殖，促进MMP2合成，抑制TIMP1、TGFβ1合成，这可能是防己黄芪汤抗内毒素干预型肝纤维化的机制之一。

　　【关键词】 大鼠 肝星状细胞 防己黄芪汤 内毒素脂多糖 TIMP1 MMP2 TGFβ1

　　Effect of Fangjihuangqi Decoction on Proliferation of Hepatic Stellate Cells in Lipopolysaccharideintervented Rats

　　FENG Jingli,SHEN Hairong,YANG Li,et al.

　　Guangzhou TCM University,Guangzhou 510405,China

　　Abstract Objective:To evaluate the effect of Fangjihuangqi decoction on proliferation of hepatic stellate cells(HSC) in rats with lipopolysaccharide(LPS) intervention.Methods:HSCT6 cells were cultured with high glucose DMEM(containing 10% FBS) with 1 EIU/mL LPS.The cells were then divided into 5 groups:blank control group,LPS group,and low,medium,and highdose of Fangjihuangqi decoction groups.MMT assay was used to consecutively determine the absorbance for 5 days.ELISA method was used to detect the secration of MMP2,TIMP1,and TGFβ1 in the HSCcultured supernatant after 48 h.Results:Fangjihuangqi decoction inhibited the proliferation of HSC,more obvious in the highdose group.Compared with the LPS group,the highdose test drug significantly increased the level of MMP2 and decreased the level of TIMP1 and TGFβ1(P<0.01).Conclusion:Fangjihuangqi decoction can inhibit the proliferation of HSC by upregulating MMP2 and downregulating TIMP1 and TGFβ1 in LPSintervented rats.

　　Key words rats hepatic stellate cells Fangjihuangqi decoction lipopolysaccharide TIMP1 MMP2 TGFβ1

　　近年研究表明，内毒素与肝纤维化的发生发展有着密切关系。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的重要成分，肝损伤状态下，肝脏对内毒素排除作用减弱，造成其在体内大量堆积，而促进肝纤维化的发展。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族中的MMP1、MMP2、MMP3在细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解过程中起着关键的作用。基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)是MMP的特异性抑制剂，是在ECM的代谢调节中与MMP对应的副调节剂，它通过抑制MMP活性，从而促进肝纤维化的发展。本实验通过观察防己黄芪汤对内毒素脂多糖(LPS)作用下大鼠肝星状细胞(HSC)增殖以及MMP2、TIMP1和转化生长因子(transtorming grouthfactorβ1,TGFβ1)的影响，探讨其抗肝纤维化的作用。

　　1 实验材料

　　1.1 实验细胞

　　大鼠HSCT6细胞株，由广州中医药大学热带医学研究所病毒室提供。

　　1.2 实验药物

　　防己黄芪汤系《金匮要略》原方，由防己、黄芪、白术、甘草、生姜、大枣组成。参考《中医方剂大辞典》[1]、《方剂学》[2]中的方法制备成防己黄芪汤水提液，1ml水提液含1g生药。将防己黄芪汤水提液置60℃水浴2小时，继以80℃水浴30min，连续3天，以间歇灭菌。以1000rpm速度离心10min，取上清，并用0.45μm和0.22μm双层微孔滤膜过滤除菌处理，-20℃保存备用。以上中药均购自广州中医药大学中药房。

　　1.3 主要试剂和仪器

　　高糖DMEN培养液HEPEPS(GIBCO);胎牛血清(杭州四季清生物制品公司);L谷氨酰胺、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶(sigma公司);EDTA(上海生物工程公司Amresco进口分装);青霉素和链霉素(华北制药有限公司);内毒素脂多糖(LPS)(BIOSHARP)。TIMP1、MMP2试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20091206，20091103)。TGFβ1检测试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司，批号：091115]。HRCJ2S超净工作台(Haier);倒置显微镜(Olympus BX600);ELX800型全自动酶标仪(美国宝特)。

　　2 实验方法

　　2.1 细胞培养

　　将HSCT6细胞株复苏后接种于含10%胎牛血清、青霉素、链霉素各为100IU/ml、谷氨酰胺终浓度为0.03%，并用0.238%Hepes调pH值至6.8的高糖达尔伯克(氏)必需基本培养基(High Glucose Dulbecco's Minimum Essential Medium,DMEM)中，37℃、5%CO2 条件下培养。待细胞长至铺满瓶底60%面积时，用0.25%的胰蛋白酶和0.02% EDTA消化30s至1min后以1∶2传代，24小时换液，72小时再次传代用于以下实验。

　　2.2 分组与给药

　　把传代后的细胞以1×108/ml浓度接种于96孔板，每孔0.1ml。待24小时细胞贴壁后，吸去培养液后再以含5%胎牛血清的高糖DMEM培养液同步化细胞并分为以下5组：空白组、内毒素脂多糖组、防己黄芪汤大、中、小剂量组。除空白组外，其他各组培养液中加入LPS使终浓度达到 1 EIU/ml[3]。防己黄芪汤大、中、小剂量组终浓度分别为10、5、2.5mg生药/ml，每组设4个复孔。

　　2.3 MTT法检测药物对大鼠HSCT6增殖的影响

　　连续5天以MTT法检测防己黄芪汤对大鼠HSCT6增殖的影响。

　　2.4 ELISA法检测HSC TGFβ、MMP2、TIMP1

　　细胞以1×108/ml浓度接种于96孔板，每孔100uL，24小时贴壁后，以上述同样条件培养48小时，终止培养并吸取上清液进行检测。检测方法按试剂盒说明书进行。

　　2.5 统计学方法

　　实验数据用(±s)表示，多组计量资料均数比较采用方差分析，配对资料采用t检验。使用SPSS 13.0统计软件进行分析处理。

　　3 实验结果

　　3.1 防己黄芪汤对LPS作用下大鼠HSCT6增殖的影响

　　与空白组比较，LPS组HSC的增殖于培养第2天达最高峰，并于第3天回落并维持一定增殖至第5天。与LPS组比较，防己黄芪汤各剂量组对LPS作用下的HSCT6增殖均有不同程度的抑制作用，且呈量效相关，见图1。图1 防己黄芪汤对LPS作用下肝星状细胞增殖影响3.2 防己黄芪汤对LPS作用下MMP2、TIMP1及TGFβ1的影响 与空白组比较，LPS组HSCT6培养上清液中的MMP2、TIMP1及TGFβ1的分泌量明显增高。大剂量防己黄芪汤明显促进HSC培养上清液中MMP2分泌，并抑制TIMP1及TGFβ1分泌，与LPS组比较，差异具有统计意义(P<0.01);中剂量防己黄芪汤对促进MMP2分泌以及抑制TGFβ1分泌有一定作用(P<0.05)，但对TIMP1分泌抑制作用并不明显，见表1。表1 防己黄芪汤对LPS作用下HSCT6MMP2、TIMP1及TGFβ1的影响(略)

　　4 讨论

　　HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节，是细胞外基质产生过多和沉积的主要细胞来源[4]。HSC是肝脏的一种非实质细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的窦周Disse间隙内，主要功能是贮存和代谢脂肪及维生素A，合成和分泌少量ECM，并会产生一定的胶原酶。 正常情况下，HSC处于静止状态。肝损伤时，HSC被激活，转化为肌纤维母细胞(MFB)，即活化HSC[5]。激活后的HSC不仅能合成促肝纤维化因子，与受体结合的能力也明显增强，这种自分泌正反馈调节是促进肝纤维化发展的关键所在。近年研究发现，内毒素也是肝纤维化发生发展的一个重要影响因素。临床资料表明，各种肝病均伴有不同程度的肠源性内毒素血症(GET)。实验研究发现，内毒素既能直接损伤肝细胞，还通过激活KUFFER细胞和肝内单核巨噬细胞释放促炎介质间接损害肝细胞，从而促进肝纤维化的进展[6]。

　　本实验结果显示，LPS能有效促进HSC的增殖，并在培养的第2天达到峰值。而防己黄芪汤各剂量组对LPS作用下的HSC增殖均有不同程度的抑制作用，且呈一定的量效关系。大剂量防己黄芪汤能有效促进MMP2分泌，抑制TIMP1及TGFβ1分泌(P<0.01)，中剂量防己黄芪汤促进MMP2和抑制TGFβ1分泌的作用明显(P<0.01)，但对TIMP1分泌的抑制作用不明显。

　　【参考文献】

　　[1] 彭怀仁.中医方剂大词典[M].北京：人民卫生出版社，1997.103.

　　[2] 谢鸣.方剂学[M].北京：人民卫生出版社，2002.53.

　　[3] 董培红，何生松，苏刚，等.内毒素对大鼠肝星状细胞活化和瘦素表达的影响[J].现代中西医结合杂志，2006,15(2):156158.

　　[4] Alcolado R，Arthur MJ，Iredale JP.Pathogenesis of liver fibrosis[J].Clin Sci，1997，92(2):103112.

　　[5] Geert A.History heterogeneity developmental biology and funetion of quiescent hepatic stellate cells[J].Semin Liver Dis，2001，21(3):311335.

　　[6] 张馨，余卫平.内毒素损伤肝脏机制的研究进展[J].2002,22(3):163166.