过敏性紫癜患儿GPⅡb/Ⅲa、P选择素及vWF检测的意义

　　【摘要】 目的 检测过敏性紫癜(HSP)患儿全血中血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa(CD41a/CD61)、P选择素(CD62P)及血浆中血管性假血友病因子(vWF)的表达水平，探讨它们在HSP发病机制中的作用。方法 应用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测HSP患儿(急性期44例，缓解期40例)及健康对照儿童(18例)空腹血CD41a/CD61、CD62P及vWF水平。结果 HSP患儿急性期CD41a/CD61、CD62P、vWF水平明显高于缓解期和对照组(P均<0.01);肾受累组CD41a/CD61、CD62P、vWF水平高于非肾受累组(P<0.01)。结论 血小板的活化及血管内皮的损伤在HSP的发病机制中起着重要作用，CD41a/CD61、CD62P、vWF水平的测定有助于了解HSP患儿早期的凝血异常，为抗凝治疗提供依据。

　　【关键词】 紫癜，过敏性;血小板膜糖蛋白类;P选择素;血管性假血友病因子;儿童

　　ZHANG Hongxia1, LIU Xuemei2, LIU Fange1, LIN Aiwei2，　DUAN Chunhong2，　YANG Xiaomei2

　　(1. Department of Pediatrics, Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China;

　　2. Qilu Children′s Hospital of Shandong University， Jinan 250022, China)

　　To investigate the role of platelet membrane glycoproteinⅡb/Ⅲa, Pselectin and von Willebrane Factor in children with HenochSchonlein purpura (HSP), and to investigate the pathological role of them in HSP. Methods The concentrations of CD41a/CD61 and CD62P were determined by flow cytometry and the level of vWF by an enzymelinked immunosorbent assay(ELISA) method in 44 patients with acute HSP, 40 patients in the recovery phase and 18 healthy controls. Results The plasma levels of CD41a/CD61, CD62P and vWF in the acute phase were significantly higher than those in the recovery phase, were higher than those in healthy controls(P<0.01), and also were higher in the renal damage group than in the nonrenal damage group(P<0.01). Conclusion Activation of platelet and damage of vascular endothelium play important roles in the pathological mechanism of HSP. Levels of CD41a/CD61, CD62P and vWF are helpful in finding the disturbance of blood coagulation，and provide a basis for anticoagulant treatments.

　　Key words: Purpura, HenochSchonlein; Platelet membrane glycoproteins; Pselectin; von Willebrane factor; Child 过敏性紫癜(henochschonlein purpura，HSP)是儿童最常见的血管炎之一。有文献报道[1]，约20～80%的HSP患儿并发肾脏损害，导致过敏性紫癜性肾炎(henochschonlein purpura nephritis, HSPN)。HSP的发病机制尚未完全明了，近年来许多研究[23]认为，HSP患儿血小板的聚集功能增强，存在血液的 高凝状态甚至有微血栓形成。血小板膜糖蛋白(platelet membrane glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa是血小板聚集的关键因素，在出血与凝血过程中起着重要作用。P选择素，即CD62P，具有介导活化血小板、血管内皮细胞与白细胞粘附的功能[4]，为血小板活化的特异性标志。GPⅡb/Ⅲa与P选择素在血循环中的变化反映了血液凝血状态的早期改变。血管性假血友病因子(von willebrane factor, vWF)是血管内皮细胞损伤的标记物，血管内皮细胞受损时可促进血小板的粘附、聚集。本研究旨在观察HSP患儿GPⅡb/Ⅲa(CD41a/CD61)、P选择素(CD62P)及vWF的变化，探讨HSP发生时凝血状态的改变、内皮细胞损害与肾脏损害的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 2007年4月至2008年1月在山东大学齐鲁儿童医院住院的HSP患儿44例，男24例，女20例， 5～13岁，均符合《实用儿科学》第七版HSP的诊断标准。急性期44例均有皮肤紫癜，其中初次发作40例，2次发作4例(初次发病恢复后1个月内复发2例，2个月内复发1例，1年内复发1例);缓解期40例(其余4例拒绝抽血)，为患儿临床症状(皮肤紫癜、腹痛、关节痛)消失2周之后;所有患儿入院前2周内未使用过激素、抗凝剂及止血剂等药物，并排除血液、肝脏及心脏疾病。患儿住院期间每周化验尿常规2次，出院后每周化验1次，随访6个月。按中华医学会儿科学会肾脏病学组小儿肾小球疾病的临床分类、诊断及治疗标准[5]，根据在HSP病程中(均在6个月内)是否出现血尿和/或蛋白尿，将HSP患儿分为肾脏受累组与非肾脏受累组。肾脏受累组：出现血尿和/或蛋白尿，并排除其他原因导致血尿及蛋白尿的肾脏疾病;非肾脏受累组：HSP发病6个月化验尿常规正常。健康对照组18例，为同期在山东大学齐鲁儿童医院查体中心健康查体儿童，男10例，女8例，4～12岁，中位年龄7.86岁，既往无血液、肝脏、肾脏及心脏疾病。

　　1.2 仪器与试剂 流式细胞仪由德国PAROPARPEC公司生产;酶标仪为澳大利亚anthos2010型; PECD61、FITCCD41a 、FITCCD62P等单克隆抗体均购自美国BD公司;vWF检测试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司。

　　1.3 标本采集 所有受检者晨起抽静脉血，分别置于含有1/10体积0.109?mmol/L枸橼酸钠抗凝液的2个试管中，充分混匀，30?min内送检。其中1管全血用于测定CD41a/CD61及CD62P;另1管用于测定vWF。所有标本以3?000?r/min(离心半径10?cm)离心10?min，取血浆置-40?℃冰箱保存，2周内检测。

　　1.4 检测方法 将荧光标记单克隆抗体PECD61分别加入3组试管中，各10?μL，第1组试管加入全血5?μL，第2、3组试管先分别加入FITCCD41a、FITCCD62P各10?μL，然后分别加入全血5?μL;振荡器混匀， 在25?℃室温避光孵育20?min后，加预冷的1%多聚甲醛1?mL震荡混匀，置于4?℃冰箱避光孵育20?min，然后利用流式细胞仪进行检测。上机时首先用第1组试管根据前向角和侧向角光散射信号设定血小板门，然后通过CD61标记进一步确认设门内血小板在95%以上。测定方法严格按照操作说明进行。vWF的检测采用酶联免疫吸附双抗体夹心法，检测前标本置37?℃水浴中迅速溶化，然后按试剂盒说明书进行操作。

　　1.5 统计学处理 统计学分析采用SPSS11.5统计学软件进行，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 HSP患儿CD41a/CD61、CD62P及vWF的水平 见表1。 HSP患儿急性期CD41a/CD61、 CD62P、 vWF水平均高于健康对照组， 差异有统计学意义(P均<0.01); 治疗后患儿皮疹、 腹痛、 关节痛消失， 进入缓解期时三者水平均下降， 急性期与缓解期比较， 差异有统计学意义(P均<0.01)。患儿缓解期CD41a/CD61、CD62P及vWF水平虽然略高于健康对照组，但差异无统计学意义(P>0.01)。表1 HSP患儿急性期、缓解期及对照组CD41a/CD61、CD62P、vWF水平的比较

　　*2.2 HSP患儿急性期肾受累组与非肾受累组CD41a/CD61、CD62P、vWF水平比较 见表2。HSP患儿随访6个月，肾受累组患儿多于1个月内(10/14)出现血尿和/或蛋白尿，其急性期CD41a/CD61、CD62P及vWF水平均高于非肾受累组，差异具有统计学意义(P均<0.01)。表2 HSP患儿肾受累组与非肾受累组CD41a/CD61、 CD62P、vWF水平的比较

　　3 讨 论

　　HSP是一种主要累及毛细血管的变态反应性疾病，其病理改变的特点为较广泛的急性无菌性毛细血管和小动脉的炎性反应，血管壁可有纤维素样坏死，微血管可因血栓形成而堵塞管腔，致灶性坏死。HSPN的肾脏改变多为局灶性肾小球病变，毛细血管内皮增生，局部纤维化和血栓形成，灶性坏死。而血栓形成的初期是由于血小板的活化，导致血小板的粘附、聚集，进一步启动凝血过程。本文检测HSP不同时期CD41a/CD61、CD62P及vWF水平的变化，旨在了解血小板的活化以及内皮细胞的损伤在HSP发病机制中的作用。

　　GPⅡb/Ⅲa存在于血小板膜表面，作为纤维蛋白原受体介导血小板聚集的最终途径，在血小板黏附、聚集中起重要作用。有研究表明[67]，在病理或生理状态下，GPⅢa构成α链， GPⅡb构成β链以1：1结合成GPⅡbⅢa复合物，当血小板受到腺苷二磷酸(Adenosine diphosphate，ADP)、凝血酶等刺激时，GPⅡb/Ⅲa被激活，其构象发生改变后与vWF因子、纤维连接蛋白(Fn)、纤维蛋白原、血管连接素结合致血小板聚集，血栓形成，提示GPⅡb/Ⅲa是血小板聚集、血栓形成的关键。P选择素，即CD62P，是一种炎症反应的标志物，是细胞黏附分子选择素成员之一，主要分布于静息血小板的α颗粒中。CD62P在静息血小板上表达量很低，当受到缺氧、自由基、凝血酶、ADP等的刺激后，发生脱颗粒反应，颗粒膜与细胞膜融合，使CD62P表达到血小板膜上，成为血小板活化的特异性标志[8]。CD62P介导白细胞和内皮细胞的起始黏附，在炎症反应和血栓形成中起着中心环节作用[4，9]，另外，更有依据[10]表明，P选择素可以促进血小板的进一步聚集，使GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原在初始阶段的结合更加稳定，形成大量稳定的血小板聚集物。因此，GPⅡb/Ⅲa 、P选择素联合检测能够反映血小板的活化状态。本研究结果显示，HSP患儿急性期GⅡb/Ⅲa与P选择素表达均明显增强，提示在HSP发病过程中存在血小板的活化、聚集。

　　目前，GPⅡb/Ⅲa、P选择素等在肾脏疾病发病机制中的作用日益引起关注。有研究表明[11]，在系膜增殖性肾炎中GPⅡb、Ⅲa在肾小球内毛细血管袢及肾小管上皮细胞表达明显上调，且P选择素表达部位与GPⅡb、Ⅲa表达部位一致，提示GPⅡbⅢa活化介导了P选择素的表达是炎性细胞浸润组织所必需的，GPⅡb/Ⅲa表达增强介导了系膜区细胞外基质进行性聚积炎性细胞浸润;血小板在肾小球内聚集、系膜区细胞外基质的聚积增加可导致肾小球的硬化。HSPN的病理改变主要表现为系膜增生性肾炎。本研究结果表明，GPⅡb/Ⅲa、P选择素水平在HSP患儿中肾脏受累组明显高于非肾脏受累组，差异有统计学意义，说明GPⅡb/Ⅲa、P选择素与HSPN的发病有一定的关系。

　　有研究发现[1213]，血浆vWF主要由血管内皮细胞合成，储存于内皮细胞胞质WeibelPalade小体内，内皮细胞分泌多种形式的vWF，包括vWF前体，二聚体亚单位和多聚体，组成多聚体的每个单体表面存在着肝素受体、因子Ⅷ受体、胶原受体、糖蛋白Ⅰb受体和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体。大分子的这些受体或结合位点是vWF介导血小板血栓形成的功能基础。Feng等研究表明[14]，当内皮细胞受损时，vWF能从内皮细胞的VeibelPalade小体分泌到血浆或血管内皮细胞下，首先通过血小板膜糖蛋白Ⅰb介导血小板与血管内皮细胞下胶原的粘附，导致血小板活化，致使GPⅡb/Ⅲa分子上vWF 受体暴露，产生vWF与GPⅡb/Ⅲa的结合反应，成为血小板与内皮成分的桥梁，促进血小板粘附和聚集，并可促进纤维蛋白原的合成，使血液粘滞性增加，有利于血栓的形成。本研究结果显示，vWF在HSP急性期升高，而且肾脏受累组较非肾脏受累组vWF水平比较，差异具有统计学意义，进一步说明了在HSP及HSPN的发病机制中存在血管内皮细胞的损伤及凝血机制的异常。因此，GPⅡb/Ⅲa、P选择素与vWF的联合检测有利于早期预测肾脏损害的发生，为抗凝治疗提供依据。

　　随着病情控制，HSP患儿的皮疹、关节痛、腹痛等临床症状消失，缓解期 GPⅡb/Ⅲa、P选择素与vWF的水平逐渐下降，但与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.01)，提示三者水平与HSP的活动性有关，其测定有助于了解病情活动及判断是否合并肾脏损害。以往测定血小板膜糖蛋白多提取血小板层，操作步骤繁琐，而且血小板分离过程中容易活化，造成误差。本研究采用全血法测定GPⅡb/Ⅲa、P选择素，从而降低血小板在体外人为活化的可能性，为反映体内血小板的活化状态提供了简单、快捷的方式。

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