TRAIL在膀胱移行细胞癌的表达与预后关系

　　【摘要】 目的 检测膀胱移行细胞癌(BTCC)和正常膀胱组织中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的表达,探讨TRAIL表达与BTCC预后的关系。方法 免疫组化Elivision法检测76例BTCC和15例正常膀胱组织病理标本中TRAIL的表达;结合临床病理学资料分析其之间的相关性。结果 76例BTCC病理标本中有45例(59.21%)TRAIL阴性表达,G2、G3组的TRAIL阴性表达率(68.63%)明显高于G1组(40.00%, P<0.05);肿瘤多发组中TRAIL阴性表达率(75.86%)明显高于单发组(48.94%, P<0.05)。logrank test分析TRAIL表达阴性组与阳性组间无复发生存率有统计学意义(P<0.05),TRAIL阴性表达组的无复发生存时间(33.65月)明显低于阳性表达组(46.49月)。结论 TRAIL在BTCC中表达下调,且与BTCC数目、分级、复发相关,可作为判断BTCC预后的参考指标。

　　【关键词】 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;膀胱移行细胞癌;基因表达;预后

　　To determine expression of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand(TRAIL) in bladder transitional cell carcinoma(BTCC) and normal bladder tissues and to explore the correlation among TRAIL and clinicopathological parameters and prognosis of BTCC. Methods TRAIL protein expression was determined by immunohistochemistry assay (Elivision). Results TRAIL negative expression was shown in 45(59.21%) of the 76 cases of BTCC, and it was higher in poorly differentiated(G2, G3) tumors than in well differentiated (G1) tumors (68.63% vs 40.00%, P<0.05), and also it was significantly higher in multiple tumors than in single tumors (75.86 % vs 48.94%, P<0.05). Survival curves determined by the KaplanMeier method and logrank test analysis demonstrated that recurrence free survival rates in the group of negative expression of TRAIL were lower than those in the group of positive expression (33.65 months vs 46.49 months, P<0.05). Conclusion Expression of TRAIL has a negative correlation with different tumor numbers, grades and recurrence of BTCC; therefore, it can be used as a promising marker for prognosis.

　　Key words： Tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand; Bladder transitional cell carcinoma; Gene expression; Prognosis 膀胱癌为泌尿系统常见的恶性肿瘤,90%以上是来自移行上皮的膀胱移行上皮细胞癌(BTCC)，其中约80%是浅表膀胱癌。 经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBt)后联合膀胱灌注化疗主要用于浅表性膀胱癌及部分T2a期膀胱癌患者[1]。术后复发率高是导致治疗失败的主要原因,因此预见BTCC患者的术后早期复发风险，提前采取个体化预防和治疗方案成为现在临床需要。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是Wiley等[2]发现的TNF 家族的新成员,与其他TNF成员相仿,TRAIL呈典型的Ⅱ型跨膜蛋白结构,可通过与其死亡受体结合，激活靶细胞内的凋亡通路，从而介导肿瘤细胞的凋亡,但对正常细胞无毒副作用。本研究通过检测BTCC组织中TRAIL的表达,探讨其与BTCC病理参数的关系及判断复发的价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 选取山东大学第二医院泌尿外科2001年11月～2007年3月期间住院的76名BTCC患者,男59例，女17例;22～81岁，平均63.62岁。WHO(1973年)分级：G125例，G238例，G313例。临床分期按国际抗癌联盟(UICC)标准:Ta期4例，T1期41例、T2a期31例。单发47例,多发29例。76例患者均行TURBT,体力状况评分0～2级(ECOG评分), 心、肺、肝、肾功能基本正常, 术后1周以丝裂霉素40?mg稀释于生理盐水40?mL内,经导尿管注入膀胱, 最初为每周1 次,共8 次,以后每月1 次共1 年。丝裂霉素总剂量720mg,定期行膀胱镜复查。

　　同时选取正常膀胱粘膜15例,其中膀胱切开取石术5例、耻骨上经膀胱前列腺摘除术5例,输尿管末端囊肿切开术5例所得的正常膀胱粘膜组织15例,男10例,女5例,34～78岁,平均61.16岁。

　　1.2 试剂 小鼠抗人TRAIL单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。磷酸盐缓冲等渗盐水(PBS)0.01?mol/L和3.3四盐酸二氨基联苯胺(DAB)显色液由本实验室自行配制。

　　1.3 石蜡切片的制备 标本经10%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,制成5?μm连续切片,贴于预先涂有3氨丙基三乙氧基硅烷(APES)的载玻片上,60?℃烤箱烘烤1?h备用。

　　1.4 免疫组化染色程序 采用Elivision 法进行免疫组化染色。石蜡切片脱蜡和水化后,用PBS(pH7.4)冲洗3?min,共3次。根据抗体的要求,对组织抗原进行相应的修复。每张切片加50?μL 3%过氧化氢溶液,室温下孵育10?min,以阻断内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗3?min,共3次。除去PBS液,每张切片加50?μL的第一抗体, 室温下孵育60?min。PBS冲洗3?min,共3次。除去PBS液,每张切片加50?μL聚合物增强剂(试剂A),室温下孵育30?min。PBS冲洗3?min,共3次。除去PBS液,每张切片加50?μL酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B),室温下孵育60?min。PBS冲洗3?min,共3次。除去PBS液,每张切片滴加100?μL新鲜配制的DAB显色液, Olyumpus BX40型光学显微镜下观察控制显色,阳性显色为棕色或棕黄色。蒸馏水或自来水冲洗,苏木素复染15?s,0.1%盐酸分化,自来水冲洗,PBS冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水,二甲苯透明中性树胶封片。以PBS 代替一抗作为空白对照。

　　1.5 结果判定 TRAIL蛋白表达阳性显色为棕黄色,以胞浆着色为主,偶见胞核着色。参考Simons MP的评判标准[3],随机计数5个高倍视野中阳性细胞的百分比，阳性细胞数<1%为0 分,1%～10%为1分,11%～50%为2分,>50%为3分;另根据染色反应的深度分别记分为0～3分,其中染色深度以肿瘤细胞的呈色反应为准。浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,不着色为0分。将这两项指标相乘(即0～9分),记录染色结果。15例正常膀胱粘膜均大于4分,定义染色4～9分为TRAIL的阳性表达;0～3分为阴性表达。Olyumpus BX40型光学显微镜观察并摄片。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS13 .0统计软件进行统计处理。两组间TRAIL表达率的差异比较采用χ2检验。绘制KaplanMeier无复发生存曲线,无复发生存率差异检验采用Logrank检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 TRAIL表达强度的判定 见图1。76例浅表膀胱癌标本中有45例(59.21%)出现TRAIL 蛋白的阴性表达,G1组TRAIL在癌巢的中心部位表达较强,而在增生旺盛的周边部位表达弱,偶见胞核表达。G3组TRAIL的表达明显减弱,呈弥漫分布,并极少见到有胞核表达。

　　2.2 TRAIL表达与BTCC病理参数的关系 见表1。G1组TRAIL阴性表达率为40.00%(10/25),G2、G3组为68.63%(35/51)(P<0.05) 。单发肿瘤组中TRAIL阴性表达率为48.94%(23/47),明显低于单发组的75.86%(22/29)(P<0.05)。患者性别、年龄、肿瘤分期、肿瘤大小与TRAIL表达无相关性(P>0.05)。

　　2.3 TRAIL表达与膀胱癌预后的关系 见图2。对76例术后的BTCC患者进行12～60月(平均30.54月)的跟踪随访.其中31例TRAIL阳性表达者的平均无复发时间为46.49个月;45例TRAIL阴性表达者的平均无复发时间为33.65个月。logrank test分析结果表明,两组的生存时间差异有统计学意义(Logrank=4.981, P<0.05)。

　　Relationship between TRAIL expression and postoperative recurrencefree survival rate of BTCC patients

　　3 讨 论

　　肿瘤形成和进展过程中,发育异常细胞凋亡的失调是一个常见现象, 最近研究发现，TRAIL表达下调是肿瘤进展的早期事件，变异、不正常细胞表达TRAIL的减少预示着其恶性程度增加[45]。

　　Takamizawa等[6]报道的TRAIL在儿童肾肉瘤和肾癌中的表达明显低于正常肾组织，且与肿瘤的临床行为相适应的结果一致。殷玉华等[7]发现的随着前列腺癌分化程度下降,TRAIL表达下调。本研究结果显示，与正常膀胱粘膜相比,TRAIL在BTCC中表达明显减少,且在G1级的BTCC中表达相对较高,而在G2、G3级的BTCC中表达下调。另外，我们还观察到，在高分化癌组织G1中,以癌巢的中心部位表达最强,而在增生旺盛的周边部位表达弱,偶见有胞核表达.而在低分化的癌组织中表达较弱,弥漫分布,极少见到有胞核表达。细胞分化程度愈差,TRAIL 表达愈弱,提示TRAIL的分布与细胞的分化有关,TRAIL阴性表达可能是分化差的标志。

　　刘胜雄等[8]报道TRAIL表达与胃癌患者的预后相关,TRAIL表达下调与浆膜有浸润、分化程度差、有淋巴结转移关系密切。本研究结果显示,TRAIL的表达与早期BTCC患者的性别、年龄、肿瘤大小,肿瘤临床分期无关;而TRAIL表达下调与膀胱癌分级、肿瘤数目、无复发生存时间相关，提示TRAIL在BTCC的发展与演变中起重要作用。进一步分析发现,TRAIL阴性表达组的BTCC患者的术后无复发生存时间明显低于正常表达组(33.65月 vs 46.49月)。提示TRAIL是一个保护性因素,在最初的BTCC发展时，TRAIL可作为一个监护者清除变异细胞，而TRAIL的下调可使它们避免凋亡，从而变异细胞克隆扩增，也就增加了BTCC复发的危险性。Ludwig等[9]研究表明,卡介苗膀胱灌注治疗浅表膀胱癌后,那些对该疗法效果明显的患者比那些无效患者的尿中的有更高TRAIL水平,在体外能杀死更多的膀胱肿瘤细胞,暗示着膀胱肿瘤患者表达TRAIL能力与其预后相关。

　　综上所述,TRAIL的表达与BTCC的发生、发展及预后有关,对TRAIL的研究可能为BTCC发生的病因、早期诊断、分子生物学治疗及预后的判断等提供新的思路。关于TRAIL在BTCC中的的具体作用机制尚待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 章咏裳. 经尿道电切术治疗膀胱及前列腺疾病[J].临床泌尿外科杂志,2000, 15(10):437438.

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　　[4] Popnikolov N K, Gatalica Z, Adegboyega PA, et al. Downregulation of TNFrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL)/Apo2L in Barrett′s esophagus with dysplasia and adenocarcinoma[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2006, 14(2):161165.

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　　[6] Takamizawa S, Okamoto S, Bishop W, et al. Differential apoptosis gene expression in pediatric tumors of the kidney[J]. J Pediatr Surg, 2000, 35(2)：390395.

　　[7] 殷玉华,姬秋和,黄威权.GnRH受体与TRAIL在前列腺肿瘤中表达的研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2004,13(2):236238.

　　[8] 刘胜雄,汤明,吴飞跃.TRAIL在胃癌中的表达及其意义[J].中国普通外科杂志,2005, 14(10): 789791.

　　[9] Ludwig AT, Moore JM, Luo Y, et al. Tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand: A novel mechanism for Bacillus CalmetteGuérininduced antitumor activity[J]. Cancer Res, 2004, 64:33863390.