自发性高血压大鼠心肌声学密度与心肌纤维化的关系及药物干预研究

　　【摘要】 目的 探讨声学密度定量分析(AD)技术评估高血压心肌纤维化的价值，同时观察苯那普利和缬沙坦对高血压心肌纤维化的作用。方法 10周龄的雄性自发性高血压大鼠(SHR)60只，随机分为SHR对照组(SHRc组)、SHR苯那普利组(SHRb组)、SHR缬沙坦组(SHRv组)和SHR联合用药组(SHRb+v组)，每组15只。用药组分别给予苯那普利、缬沙坦或二者半剂量合用灌胃10周，并以Wistar京都(WKY)大鼠15只为正常对照(WKY组)。应用AD技术获取各组大鼠左室相应部位心肌背向散射积分(IBS)与背向散射积分周期变化值(CVIB);测定其收缩压(SBP)、左室重量(LVM)以及左室重量指数(LVMI)和左室心肌羟脯氨酸浓度(HC);Masson染色观察心肌胶原含量变化，测量心肌胶原容积分数(CVF)和心肌内血管周围胶原面积(PVCA),并对所得指标进行相关分析。结果 与WKY组相比，SHRc组大鼠SBP、LVM、LVMI、HC、CVF、PVCA、IBS均明显升高(P<0.01)，而CVIB明显降低(P<0.01),三个用药组以上指标均明显改善(P<0.05, P<0.01)。除血压外，其他指标均以联合用药组改善最为显著(P<0.05, P<0.01)。相关分析显示，HC与CVF及PVCA均呈显著正相关(r=0.921、0.885,P<0.01)。室间隔及左室后壁IB%值与CVF(r=0.731、0.756，P<0.01)及PVCA(r=0.776、0.788，P<0.01)均呈显著正相关，而CVIB值与CVF(r=-0.642、-0.716，P<0.01)及PVCA(r=-0.720、-0.755,P<0.01)均呈显著负相关。结论 AD技术是评估高血压心肌纤维化及其严重程度的一项可靠技术。苯那普利和缬沙坦可显著降低血压、减轻自发性高血压大鼠早期心肌纤维化，且二者合用可明显减轻心肌纤维化程度。

　　【关键词】 高血压;自发性高血压大鼠;声学密度;心肌纤维化

　　WANG Jing1， DU Naili2， ZHAO Zhuo2， HAO Enkui2, XIANG Youzhang3

　　(1. School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2.Department of Cardiology, Jinan Central Hospital, Shandong University, Jinan 250013, China;

　　3.Shandong Provincial Institute for Endemic Disease Control, Jinan 250014, China)

　　To evaluate the quantitative acoustic densitometry (AD) technique in myocardial fibrosis diagnosis and to explore the effects of benazepril and valsartan on myocardial fibrosis. Methods Sixty tenweekold male spontaneously hypertensive rats (SHRs) were randomly assigned to the control group(SHRc group), the benazepril group(SHRb group), the valsartan group(SHRv group) and the combination group(SHRb+v group), which were subjected to an intragastric administration for ten weeks. Fifteen male agematched WistarKyoto (WKY) rats served as the control group. The integrated backscatter (IBS) and cyclic variation of the integrated backscatter (CVIB) were assessed with the AD technique. The cardiac collagen fraction(CVF) and perivascular circumferential area(PVCA) were determined by Masson staining. Myocardial hyproconcentration(HC) were measured by a spectrophotometric method. Also, systolic blood pressure(SBP), left ventricular mass (LVM) and left ventricular mass index(LVMI) were observed. Correlation analysis among the above indexes was analyzed. Results Compared with the WKY group, levels of SBP, LVM, LVMI, HC, CVF, PVCA and IBS were all significantly increased in the SHRc group(P<0.01), while CVIB was significantly decreased(P<0.01), and the indexes were substantially ameliorated in the three treated SHR groups(P<0.05, P<0.01). Except for SBP, the combination group showed a more pronounced amelioration than the other two monotherapy groups (P<0.05, P<0.01). An intimately positive correlation was found between HC and CVF(r=0.921, P<0.01)　or PVCA　(r=0.885, P<0.01). Normalized values of integrated backscatter at the interventricular septum and left ventricular posterior wall were positively related to CVF　(r=0.731, 0.756，P<0.01)　and PVCA　(r=0.776, 0.788，P<0.01), while both CVIBs were inversely related to CVF(r=-0.642,-0.716，P<0.01)and PVCA　(r=-0.720, -0.755, P<0.01). Conclusion Myocardial ultrasonic backscatter parameters are closely correlated with the alteration of myocardial collagen contents. Quantitative myocardial acoustic densitometry is a reliable technique for detecting myocardial fibrosis and evaluating its severity. Benazepril and valsartan decrease the blood pressure and can reverse an early myocardial fibrosis in SHRs. Benazepril in combination with valsartan is more effective in ameliorating myocardial fibrosis than either one alone.

　　Key words： Hypertension; Spontaneously hypertensive rat; Acoustic densitometry; Myocardial fibrosis 近年研究表明[1]，应用声学密度定量分析(AD)技术可对心肌组织学异常进行量化评价，客观反映高血压心肌纤维化的严重程度。但检测心肌纤维化的金标准是病理学检查，心肌声学密度与病理学检查的对比结果如何，目前研究尚不充分。为此，本研究以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)为动物模型，探讨心肌声学密度与心肌胶原改变的相关性，同时观察血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)苯那普利和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)缬沙坦对高血压心肌纤维化的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型与分组 8周龄雄性SHR 60只和同龄雄性Wistar京都(WKY)大鼠15只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，体质量(BW)180～220?g,适应性喂养2周后，随机分为正常对照组(WKY组);SHR对照组(SHRc组);SHR苯那普利组[SHRb组，苯那普利10?mg/(kg·d)];SHR缬沙坦组[SHRv组，缬沙坦30?mg/(kg·d)];SHR联合用药组[SHRb+v组，苯那普利5?mg/(kg·d),缬沙坦15?mg/(kg·d)]，每组15只。自10周龄始，将药物混于少量蒸馏水灌胃10周，WKY和SHRc组只给予等量蒸馏水作对照。每周称重1次，按体重调整用药。

　　1.2 收缩压(SBP)的测定 采用RBP1型鼠尾血压心率测定仪(中日友好临床医学研究所研制)，测量大鼠清醒状态下的尾动脉收缩压。

　　1.3 心肌声学密度指标的测定 所有大鼠均以2%戊巴比妥钠2?mL/kg腹腔麻醉后胸前剃毛、固定。应用PHLIPS 7500型彩色多普勒超声诊断仪，S8探头，图像深度3?cm,增益固定为50?dB，横向增益(TGC)曲线置于中部，纵向增益(LGC)曲线置于零线，条件设置在研究过程中不变。取标准胸骨旁左室长轴切面，进入ADIBS状态，采集2.48?s的动态二维图像，记录于磁光盘供脱机分析。调整超声设置进入ADIBS状态，读取磁光盘信息。将感兴趣区(ROI)设置为11×11像素取样框，分别置于室间隔中部、左室后壁中部及心腔。根据图像分析结果，仪器可自动计算出以下AD值：峰-峰强度(peak to peak intensity, PPI)，即背向散射积分周期变化值CVIB;图像平均强度(average image intensity, AII)，即背向散射积分IBS。用心肌IBS与心腔IBS比值作为心肌校正IBS(IB%)。

　　1.4 左室质量(LVM)、左室质量指数(LVMI)的测定 断头处死大鼠，开胸, 迅速取出心脏,预冷生理盐水洗净,滤纸吸干,沿房室沟剪掉两心房,剪掉主、肺动脉,紧贴室间隔右侧剪掉右心室游离壁,剩余为左心室(含室间隔)，称重，并计算LVMI=LVM/体重。

　　1.5 心肌组织羟脯氨酸浓度(HC)的测定 采用Bergman法，称取约100?mg湿重的心肌组织，应用2∶1?氯仿甲醇混合液进行脱脂，再用4∶1乙醇水混合液和丙醇冲洗过滤，60?℃烘干后加6?mol/L HCl 1.5?mL，110?℃酸解12?h，调pH至7.0。吸取20?μL稀释成4?mL， 再取2?mL 加0.05?mol/L氯胺T室温培养20?min，3.15?mol/L过氯酸1?mL氧化5?min后，加1?mL　10%对二氨基苯甲醛显色液显色，在546?nm波长下比色，测定羟脯氨酸浓度(μg/100?mg湿重)。羟脯氨酸在胶原蛋白中占14%，这一比值是恒定的。

　　1.6 心肌胶原定性和定量分析 取左室中段横截面心肌组织，10%中性福尔马林液固定， 石蜡包埋， 4?μm切片， 进行Masson染色。 在Masson染色下， 心肌细胞呈红色， 胶原呈绿色。 光镜下观察胶原含量变化情况， 应用HP IAS2000型计算机图像分析系统，随机分析5个视野，通过灰度调节区分胶原与非胶原成分， 测量心肌胶原容积分数(CVF)和心肌内血管周围胶原面积(PVCA)。 CVF=胶原面积/总面积，其中胶原面积不包括血管周围胶原面积。PVCA=心肌内小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积。

　　1.7 统计学处理 应用SPSS 11.5统计软件，所有数据以

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠BW、SBP、LVM、LVMI和HC测定结果 全部试验过程中大鼠意外死亡2只，其中SHRc组1只、SHRb组1只。SHRb组大鼠体重相对较低，但各组差异尚无统计学意义。SHRc组SBP、LVM、LVMI和HC均显著高于WKY组(P<0.01)，各用药组SBP、LVM、LVMI和HC均显著降低(P<0.01);联合用药组LVMI和HC较两单用药组降低更显著(P<0.05，P<0.01),两单用药组间无差异;三用药组间SBP差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1。 表1 各组大鼠体质量、血压、左室质量及左室质量指数测定结果表2 各组大鼠心肌声学密度指标测定结果

　　3 讨 论

　　SHR是一种与人类高血压病接近的慢性高血压动物模型，于6周龄时血压开始升高，至10周龄时左室肥厚和心肌纤维化已经建立，并且随着鼠龄的增长而逐渐加重[2]。因此本研究选择SHR 10周龄为起点，结果显示,20周龄SHRBP、LVM、LVMI、心肌HC均显著高于同龄WKY，提示模型建立成功。

　　心肌纤维化的诊断可采用超声心电图、X线等检查，但均难以直接特异地量化评价心肌纤维化的程度,而病理学检查作为一种有创检查，临床应用受到限制。因此，心肌纤维化的量化评价一直是临床亟待解决的难题。

　　AD技术是近年发展起来的一种以超声背向散射积分为基础的新型无创超声诊断技术, 可通过测定心肌声学密度参数来定量评价心肌组织学特性[3]。心肌背向散射积分值(IBS) 和背向散射积分周期变化幅度(CVIB)是其常用的测量指标。IBS 值可反映心肌组织成分和结构的变化，而CVIB 值与心肌收缩功能相关[1,4], Bi等[5]研究显示，应用多巴酚丁胺可使正常心肌CVIB增加, 普奈洛尔则使之减低，但两者对IBS 均无明显影响。有学者发现入射声波与心肌纤维走行方向成不同角度时, 其背向散射将不同, 胶原纤维方向与超声束垂直时，IBS值最大，二者方向平行时，IBS值最小[6]，而且，由于受探头频率、探测深度、聚焦点水平等技术因素的影响,IBS绝对测量值常不能准确反映组织学差异，多采用标化背向散射积分值(IB%), 以舒张末期心包的IBS 值为100%, 检测区IBS值与其相比即为IB%[1]。但Voon等[7]通过对23个无心包炎病史者的心包标本用50～70?dB的均等时间增益补偿下获得的2 D IBS影像加以分析, 认为心包并不是一个理想的校正参考。因此本研究采用心肌IBS与心腔IBS比值作为观察指标。结果显示，SHR室间隔及左室后壁心肌IB%均显著高于WKY组， CVIB显著低于WKY组，而三个药物治疗组较SHR对照组IB%值均显著降低，CVIB均显著升高，提示SHR心肌发生组织学改变，心肌收缩力减弱，而药物干预可逆转这种改变。相关分析显示，超声背向散射指标与CVF及PVCA均关系密切，而此前已有研究证实IBS强度与心肌胶原含量呈线性关系[8]。因此，我们认为AD技术是一项可无创评估高血压心肌纤维化及其严重程度的可靠技术。

　　肾素-血管紧张素系统(RAS)在高血压心肌纤维化的发生和发展过程中起着重要作用， ACEI和ARB分别作用于RAS的不同环节，发挥降压、改善心肌纤维化作用，二者联用具有理论基础，但到目前为止二者合用在高血压治疗方面尚无定论。本研究结果表明，半剂量联合应用苯那普利和缬沙坦不但可以有效降压，而且较单用苯那普利或缬沙坦可以更显著改善心肌纤维化。究其原因，首先RAS参与心肌纤维化过程的主要活性介质是AngⅡ，ACEI可减少AngⅡ的生成，ARB是AngⅡ的竞争性拮抗剂，二者合用可从不同位点阻滞AngⅡ的作用; ARB可有效拮抗旁路途径生成的AngⅡ, ACEI可抑制ARB引起的AngⅡ反应性升高[9];ACEI与ARB合用较单用可更显著促进内皮NO生成、提高NO生物利用度，改善内皮功能[10];ACEI抑制ACE，使AngⅠ水平升高，生成的Ang(1～7)有利于逆转心肌纤维化[11];有证据显示，AT2受体过分激活后对心血管组织有致肥大的作用，并可导致血管生成中断[12]，小剂量合用ACEI与ARB较单用ARB可有效避免AT2受体的过分激活，从而发挥其良性作用[13]。可见，ACEI与ARB合用不仅有正协同作用，还因剂量减半而减少副作用的发生。Shibasaki等[14]研究发现，在相同降压水平上，洛沙坦较依那普利和氨氯地平可更有效地逆转终末期肾病患者的心肌纤维化。本研究结果提示，缬沙坦与苯那普利单用在改善心肌纤维化方面略有差异，但无明显统计学意义。另外， Chow等[15]在观察不同剂量的苯那普利与缬沙坦对SHR糖代谢和血脂水平的影响时发现，不同剂量的苯那普利都可明显抑制SHR体重增加，而缬沙坦组不论何种药物剂量，大鼠体重较对照组均无差异。本研究亦发现苯那普利组SHR体重较其他治疗组偏低，但尚未达统计学差异。考虑可能因观察时间短、样本量小等导致有关结果的偏差。关于ACEI与ARB单用在逆转高血压心肌纤维化的疗效对比及苯那普利抑制体重增加的机制尚需进一步探讨。

　　【参考文献】

　　[1] 〖ZK(#]Galetta F, Bernini G, Franzoni F, et al. Preclinical cardiac involvement in phaeochromocytoma: A study with integrated backscatter[J]. Clin Endocrinol (Oxf), 2008, 68(5):756761.

　　[2] Makino N, Sugano M, Otsuka S, et al. Molecular mechanism of angiotensin Ⅱ type 1 and type 2 receptors in cardiac hypertrophy of spontaneously rats[J].Hypertens, 1997, 30(4):796802.

　　[3] Mizuno R, Fujimoto S, Saito Y, et al. Noninvasive quantitation of myocardial fibrosis using combined tissue harmonic imaging and integrated backscatter analysis in dilated cardiomyopathy[J]. Cardiology, 2007, 108(1):1117.

　　[4] AghiniLombardi F, Di Bello V, Talini E,et al. Early textural and functional alterations of left ventricular myocardium in mild hypothyroidism[J]. Eur J Endocrinol, 2006, 155(1):39.

　　[5] Bi X, Deng Y, Pan M, et al. Influence of contractility on myocardial ultrasonic integrated backscatter and cyclic variation in integrated backscatter[J]. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci, 2002, 22(3):233234, 259.

　　[6] FinchJohnston A E, Gussak H M, Mobley J, et al. Cyclic variation of integrated backscatter: dependence of time delay on the echocardiographic view used and the myocardial segment analyzed[J]. J Am Soc Echocard, 2000, 13(1):917.

　　[7] Voon W C, Chiu C C, Su H M, et al. Is pericardium a suitable calibration reference in integrated backscatter analysis?[J] Ultrasound Med Biol, 2004, 30(8):10631066.

　　[8] Lin Y H, Shiau Y C, Yen R F, et al. The relation between myocardial cyclic variation of integrated backscatter and serum concentrations of procollagen propeptides in hypertensive patients[J]. Ultrasound Med Biol, 2004, 30(7):885891.

　　[9] Ke Y S, Cao H, Yang T. Effect of combination of valsartan with benazepril on blood pressure and left ventricular hypertrophy in SHR[J].Acta Pharmacol Sin,2000, 21(11):10431047.

　　[10] 〖ZK(#]Imanishi T, Kuroi A, Ikejima H, et al. Effects of angiotensin converting enzyme inhibitor and angiotensin II receptor antagonist combination on nitric oxide bioavailability and atherosclerotic change in Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits[J]. Hypertens Res, 2008, 31(3):575584.

　　[11] Hnber K, Pachinger O, Pichler M, et al. Pathophysiological mechanisms of the renninangiotensin system and its pharmacologic modification by ACE inhibitors or angiotensin Ⅱ(type 1) receptor blockers in cardiovascular diseases[J].Z Kardiol, 1997, 86(4):239250.

　　[12] Lévy B I. Can angiotensin Ⅱtype 2 receptors have deleterious effects in cardiovascular disease? Implications for therapeutic blockade of the reninangiotensin system[J]. Circulation, 2004, 109(1):813.

　　[13] 郑永红，白玉茹，胡锡衷，等.小剂量联合应用缬沙坦和雷米普利对原发性高血压大鼠体内NO水平及心肌重塑的影响[J].中国全科医学,2007,10(3):211214.

　　[14] Shibasaki Y, Nishiue T, Masaki H, et al. Impact of the angiotensin II receptor antagonist, losartan, on myocardial fibrosis in patients with endstage renal disease: assessment by ultrasonic integrated backscatter and biochemical markers[J]. Hypertens Res, 2005, 28(10):787795.

　　[15] Chow L, de Gasparo M, Levens N. Improved glucose metabolism following blockade of angiotensin converting enzyme but not angiotensin AT1 receptors[J].Eur Pharmacol, 1995, 282(13):7786.