DT3染毒大鼠肺脏组织损伤与灌洗液LDH、TAOC、TP浓度变化的研究

　　【摘要】 目的 探讨单推3(DT3)的肺脏毒性效应及其机制。方法 气管滴注染毒建立染毒模型，对SPF Wistar雄性大鼠连续染毒14?d，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)对染毒组大鼠支气管肺泡灌洗液中的乳酸脱氢酶(LDH)、总抗氧化力(TAOC)、总蛋白质(TP)进行检测。结果 高剂量组大鼠支气管肺泡灌洗液中LDH浓度显著性升高，TAOC浓度显著性降低(P均<0.05)，TP浓度各实验组与对照组差异无统计学意义。单细胞凝胶电泳实验测定肺组织细胞损伤荧光镜下可观察到随染毒剂量的增加，尾部DNA含量与尾矩有增加的趋势。结论 DT3可引起肺脏的炎性反应导致膜损伤，高剂量时，由自由基引起的氧化损伤表现明显。彗星实验无法排除其引起DNA损伤的可能性。

　　【关键词】 毒性试验;彗星试验;支气管肺泡灌洗液;单推3;大鼠，Wistar

　　ZHANG Mingliang1,　HOU Lian2, ZHANG Zhili1

　　(1. Second Artillery Engineering College, Xi′an 7100251, China;

　　2. Engineering Design and Research Institute of Second Artillery Corps, Beijing 100011, China)

　　DT3 which is widely used in the aerospace field as a closedcorrectposecontrol propellant, has become the focus of concern because of its safety, especially in respect to its toxicology. To explore DT3 on the toxicology of lungs and its mechanism. Methods SPF Wistar male rats were given the drug by bronchial injection 14 consecutive days. Results The levels of LDH, TAOC and TP in the bronchalveolar lavage were determined through ELISA, the level of LDH was significantly increased and TAOC significantly decreased (P<0.05) at a high dose, while no statistical significance of the TP concentration was found in all groups. Also, tail DNA intensity and tail moment were increased in a dosedependent manner in lung tissue cells as determined by fluoroscope through single cell gel electrophoresis. Conclusion DT3 might result in membrane damage by producing lung inflammation. Oxidant damage is not a contributing factor in toxicity at a low dose. The possibility that DT3 induces DNA damage could not be ruled out.

　　Key words: Toxicity tests; Comet assay; Bronchoalvolar lavage fluid; DT3; Rats, Wistar 本研究对推进剂单推3(DT3)染毒大鼠肺组织病理损伤和肺泡灌洗液中的乳酸脱氢酶(LDH)、总抗氧化力(TAOC)、总蛋白质 (TP)的变化及其机制进行研究。以期为深入探讨DT3的肺毒理机制和筛选DT3的相关生物标志物提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与材料 SPF Wistar雄性大鼠由中国军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK(军)2002001;UV9100紫外/可见分光光度计系北京瑞利科学仪器厂生产;BX51荧光显微镜系日本Olympus公司生产;Dragon WellScan MK3全自动多功能型酶标仪由芬兰雷勃公司提供;生化试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组及染毒处理 选用SPF Wiatar雄性大鼠24只，体质量180～200?g。随机分为4组，每组6只，分别为DT3高、中、低剂量染毒组及对照组，DT3经气管滴注染毒，高、中、低剂量组剂量分别为18.3、9.2、3.7?mg/kg，滴注量为0.1?mg/10?g体质量，对照组在同等条件下气管滴注等量生理盐水，给药期间，每2?d称重1次，连续染毒14?d，染毒期间，动物自由进食和饮水，最后1次染毒后动物禁食不禁水。

　　1.2.2 支气管肺泡灌洗液的制备 在最后1次染毒24?h后，乙醚麻醉下打开腹腔，腹主动脉放血处死后，将胸腔打开，用6?mL 37?℃生理盐水作为灌洗液对右肺灌洗，将灌洗液缓慢注入肺内，同时轻轻按摩胸壁，然后缓慢抽出灌洗。

　　1.2.3 单细胞悬液的制备 取各染毒组大鼠左侧肺叶上部组织在玻璃匀浆器内制成15%的组织匀浆液,收集上清液。

　　1.2.4 乳酸脱氢酶、总抗氧化力与总蛋白质的测量 支气管肺泡灌洗液中LDH、TAOC、TP浓度的检测方法采用南京建成生物工程研究所试剂盒，严格按照测试盒说明书在紫外/可见分光光度计上操作。

　　1.2.5 单细胞凝胶电泳[1] 参照文献[1]分6步：①细胞悬液的制备;②制片;③细胞裂解;④解旋及电泳;⑤中和;⑥染色。

　　结果评价：用Casp软件结合标尺对每个样品图象进行尾长、尾部DNA含量、尾矩和Olive尾矩分析。

　　1.2.6 肺组织病理学检测 取大鼠的左侧肺叶中部,置于4%甲醛溶液中固定并制成石蜡切片，用于HE 染色，光镜观察各组肺组织病理变化情况。

　　1.3 统计学处理 使用SPSS13.0软件对实验资料进行统计分析，实验所得数据以±s表示，采用SPSS软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行组间差异的显著性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠的体质量变化 大鼠体质量从第4天开始，高剂量组与对照组比较，从第8天开始，高剂量组与中剂量组、低剂量组和对照组比较，从第12天开始， 中剂量组与对照组比较，差异有统计学意义(P均<0.05)，见图1。

　　2.2 大鼠支气管肺泡灌洗液中LDH、TAOC、TP的变化 高剂量组大鼠支气管肺泡灌洗液中LDH浓度与中剂量组、低剂量组和对照组比较，差异显著(P<0.05);高剂量组中TAOC浓度与对照组比较，明显降低(P<0.05);而TP浓度各实验组与对照组间差异不显著，见表1。

　　LDHTAOCTP对照组1?015.13±300.42 0.82±0.120.10±0.03低剂量组1?042.62±332.22 0.69±0.200.12±0.03中剂量组1?150.22±146.95 0.64±0.140.11±0.03高剂量组1?466.19±201.34*▲△0.60±0.12*0.13±0.03 *P<0.05 vs 对照组;▲P<0.05 vs 低剂量组;△P<0.05 vs 中剂量组DT3各组染毒大鼠肺组织形态学变化

　　3 讨 论

　　研究[2]表明，大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中高剂量组的LDH与对照组比较，含量有所增加(P<0.05)。LDH是一种胞浆酶，来源于上皮细胞、中性粒细胞和肺泡巨噬细胞。正常情况下，由于细胞的衰老死亡，细胞外液中存在一定活力的LDH，当细胞受损伤或膜通透性增加时，LDH会大量逸出细胞外，使细胞外液中LDH活力增加。Henderson等[3]认为BALF中蛋白含量、LDH、ACK、ACP的升高分别表示血清蛋白渗出、细胞损伤或破坏、细胞膜破碎、吞噬细胞活性增高或破坏。BALF中总蛋白是反映呼吸膜屏障受损的指标。本研究各剂量组的BALF中TP变化无统计学意义。表明DT3不引起血管通透性增强。大鼠经DT3气管滴注染毒后，BALF中LDH活力增加，表明DT3对肺组织细胞有损伤作用，可能是DT3的毒性作用引起炎症反应而致膜损伤造成的。同时观察肺组织病理变化，可见肺组织毛细血管出血，肺泡间隔增宽，肺泡腔内出现炎细胞浸润，尤其在高剂量染毒组，有大量的炎细胞出现。这表明DT3气管滴注染毒后可以造成肺组织的细胞损伤。大鼠肺组织可能对DT3引起的细胞损伤存在一个阈剂量，这有待进一步研究。

　　机体存在一定程度的代偿反应。当抗氧化防御系统的代偿反应不足以拮抗氧化应激就会造成肺组织细胞损伤[46]。TAOC是清除自由基的主要防御体系，反映机体防御体系的抗氧化能力的强弱。它能保护细胞膜结构和功能的完整性，以往的研究资料表明[710]，肼和它的衍生物体内代谢产物被认为可产生自由基，并通过与组织中大分子细胞结合形成共价键或引发抗氧化过程如脂质过氧化从而产生细胞毒性。其中甲基、乙酰基、羟基等自由基已经在肼的体内代谢过程被观察到。Noda[11]发现，预先给兔注射细胞色素P450诱导剂苯巴比妥，间隔一定时间后再给予肼，可使实验兔的肝损伤加重。因此，推测肼致肝损伤作用的机理为肼在肝细胞内代谢过程中所产生的自由基中间产物使生物膜中的脂质产生过氧化作用，由此增加细胞的脆性，损伤巯基酶，对细胞产生毒效应。本研究结果表明，DT3高剂量时氧自由基产生过多, 而清除能力不足，总抗氧化能力下降，导致肺组织氧化应激损伤。

　　彗星实验检测大鼠肺组织细胞DNA 损伤, 结果表明,DT3只是对细胞DNA造成轻度损伤，DNA碎片产生较少且慧尾较短，染毒组中尾部DNA含量与尾矩及对照组比较，差异无统计学意义，但随染毒剂量的增加，尾部DNA含量与尾矩有增加的趋式。大鼠肺组织彗星细胞尾长增加的现象, 可能与其所致DNA 损伤有关，表明DT3不具有明显的遗传毒性。但同时本研究结果无法排除其具有遗传毒性的可能性。

　　综上所述,可得出如下结论:①DT3可引起大鼠肺脏的炎性反应，其炎性反应作用呈剂量依赖性;②高剂量时，由自由基引起的氧化损伤表现明显;③彗星实验观测DT3对各剂量组肺细胞DNA造成轻度损伤，因此，无法确认DT3可引起DNA损伤。

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