碳青霉烯酶OXA72在毕赤酵母中的表达和纯化

　　【摘要】 目的 对我国临床分离的第一株鲍曼不动杆菌产生的碳青霉烯酶OXA72在毕赤酵母表达系统中进行重组表达及分离纯化。方法 提取临床分离的鲍曼不动杆菌菌株40的基因组DNA，PCR扩增oxa72全基因;将oxa72基因双酶切回收后与毕赤酵母表达载体连接，重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定;电转化法将线性化的重组表达DNA转导入GS115感受态细胞，在Zeocin平板上筛选阳性转化子，并通过PCR和Western进行验证;对阳性克隆进行头孢硝噻吩实验，检测表达OXA72的活性。用镍柱分离纯化OXA72。结果 以该株鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板，用目的引物进行PCR可获得843?bp的特异扩增条带;DNA测序证明核苷酸序列与Genbank公布的oxa72基因序列100%一致;电转化后经Zeocin平板筛选得到一株阳性克隆，SDSPAGE表明重组蛋白的相对分子量在34～43?kDa之间，Westem blot分析显示，重组蛋白能特异地与抗HisTag抗体结合。头孢硝噻吩试验为阳性。纯化得到纯度为95%的重组蛋白，纯化回收率达40%。结论 成功构建了OXA72的表达载体，在毕赤酵母中成功地表达并分离纯化了具有酶活性的OXA72。

　　【关键词】 碳青霉烯酶OXA72;巴斯德毕赤酵母;表达;纯化

　　HAN Jin1, WU Dawei1, FENG Jinbo2, GENG Zhiying3，　YANG Lei1, LI Qiaorong1

　　(1. Department of Intensive Care Unit, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2. Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Function Research, Chinese Ministry of Education and Chinese Ministry of

　　Public Health, Jinan 250012, China;3. Dongying People′s Hospital, Dongying 257091, Shandong, China)

　　To amplify and identify the chromosomal DNA of Acinetobacter Baumanii which is the first isolate producing carbapenemase OXA72 in our country and to express and purify OXA72 in Pichia pastoris. Methods This study amplified the oxa72 gene by PCR using the extracted genomic DNA of the isolate 40 which was obtained from the clinic as a template. After the amplified gene was cloned into vector pGAPZalphaA, linearized recombinant plasmid oxa72pGAPZalphaA was transformed to Pichia pastoris GS115 by electroporation. Then the positive transformants were screened by colony PCR, western blot analysis and Nitrocefin test. Then we purified OXA72 with a nickel column. Results The DNA sequence amplified by PCR from isolate 40 was identical with blaOXA72 (GenBank accession numbers AY739646). One positive transformant had a positive Nitrocefin test. SDSPAGE showed that the relative molecular weight of the recombined protein was 34?kDa43kDa. Western blotting showed the combined protein could specifically bind to the Histag antibody. The recombinant protein was obtained by purification with 95% final purity and 40% recovery rate. Conclusion We successfully expressed and purified the carbapenemase OXA72 in Pichia pastoris.

　　Key words: Carbapenemase OXA72; Pichia pastoris; Expression; Purification

　　碳青霉烯酶是指能够明显水解碳青霉烯类抗生素的一类β内酰胺酶。D型β内酰胺酶水解异癋唑青霉素苯唑西林(oxacillin)比水解经典的青霉素例如青霉素G要迅速得多，因此也被命名为OXA[1]。具有碳青霉烯水解活性的OXA，即OXA型碳青霉烯酶有40余种，OXA72是首先在泰国发现的一种D型碳青霉烯酶[2], 2006年我们报道了临床分离的我国第一株能分泌OXA72的鲍曼不动杆菌菌株(菌株40)[3]，其基因序列与Genbank公布的oxa72基因序列100%一致。为了进一步研究OXA72的结构、性质和功能特点，本研究构建了OXA72的酵母表达载体，在毕赤酵母中成功的表达并纯化出具有活性的OXA72蛋白。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要标本与试剂 鲍曼不动杆菌菌株40于2002年自济南军区总医院从一名医院获得性肺炎患者的痰液中分离得到。DH5α大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母GS115株和酵母表达质粒pGAPZαA由教育部和卫生部心血管重构与功能研究重点实验室保存。longTaq DNA聚合酶购自北京天根生化科技有限公司;EcoRI、KpnI内切酶、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物公司;AvrII内切酶、DNA marker购自Fermentas公司;Zeocin购自Invitrogen公司;His tag selector kit购自Qiagen公司;其它常规试剂均为分析纯产品。

　　目的引物P1、P2根据Genbank公布的OXA72的基因序列设计，由博尚生物公司合成。P1 5′GCGAATTCATGAAAAAATTTATACTT3′为上游引物，P2 5′GCGGTACCCCAATGATTCCAAGATT3′为下游引物，引物两端用下划线标出的碱基序列分别为EcoRI和KpnI酶切位点。载体引物PGAP Forward和P3′AOX1参见Invitrogen公司操作手册，由北京华大基因研究公司合成。PGAP Forward 5′GTCCCTATTTCAATTGA3′为上游引物，P3′AOX1 5′GCAAATGGCATTCTGACATCC3′为下游引物。

　　1.2 方法

　　1.2.1 oxa72基因的扩增和鉴定 提取鲍曼不动杆菌菌株40的总DNA，以之为模板，用目的引物P1、P2进行PCR，反应体系为50?μL，条件为94?℃×5?min 1个循环，94?℃×1?min、48?℃×1?min、72?℃×1?min 35个循环，72?℃×10?min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.2 表达载体pGAPZoxa72的构建 PCR扩增产物经EcoRI和KpnI双酶切、回收，连接pGAPZαA，得到重组质粒pGAPZoxa72，转化E coli DH5α，得到E coli DH5α(pGAPZoxa72)，扩增后提取重组质粒pGAPZoxa72，以之为模板，用载体引物进行PCR，反应条件为94?℃×5?min 1个循环，94?℃×1?min、54?℃×1?min、72?℃×1?min 35个循环，72?℃×10?min，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测;重组质粒进行双酶切和测序鉴定。

　　1.2.3 酵母细胞的转化 用AvrII酶切重组质粒pGAPZoxa72使之线性化，然后电击转化入GS115酵母细胞中，利用含Zeocin的YPDS平板筛选阳性转化子。同时以AvrII线性化的不含oxa72的空质粒pGAPZαA电转化GS115作对照。

　　1.2.4 阳性转化子的鉴定 提取酵母基因组DNA，以之为模板，用目的引物和载体引物分别进行PCR，反应条件同上，以验证阳性克隆GS115(pGAPZoxa72)和GS115(pGAPZαA)。采用超声法破碎培养72?h的阳性克隆GS115(pGAPZoxa72)和GS115(pGAPZαA)的菌体，然后离心取上清液，与培养上清液一起用无水乙醇沉淀，用His tag antibody做Western blot analysis。

　　1.2.5 头孢硝噻吩实验 用含有高浓度Zeocin的YPD平板二次划线筛选阳性克隆，挑取单克隆至5?mL?培养液中，30?℃、220?r/min震荡培养72?h，离心，将上清液转移至新EP管中，用等体积YPD培养基重悬菌体，分别向菌体溶液和上清液中滴加一滴头孢硝噻吩，观察溶液颜色的变化，同时以GS115(pGAPZαA)菌株和GS115菌株做对照。

　　1.2.6 重组蛋白的纯化 采用镍琼脂糖凝胶柱色谱分离重组蛋白。缓冲液平衡镍柱后将20?mL细胞破碎液上样，再用缓冲液洗柱后，分别用50、200?mmol/L咪唑缓冲液进行阶段洗脱，收集各阶段洗脱峰，SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色检测重组蛋白的分子量大小和纯度。

　　2 结 果

　　2.1 oxa72基因的PCR扩增结果 1%琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增得到约843?bp的oxa72基因，且未见非特异性扩增条带。

　　2.2 表达载体pGAPZoxa72的构建 1%琼脂糖凝胶电泳显示，用载体引物进行PCR扩增pGAPZoxa72，得到的片段长度约为1?340?bp;双酶切pGAPZoxa72得到约840?bp和约3?kb的两片段(图1)，与预期一致;用载体引物对pGAPZoxa72测序，将测序序列进行blast，结果显示，克隆的oxa72基因与Genbank中oxa72基因序列(GenBank accession number AY739646 )完全一致;这表明oxa72的酵母表达载体构建成功。

　　2.3 重组酵母GS115(pGAPZoxa72)的筛选和鉴定 挑取含有Zeocin的YPDS平板上的阳性转化子并扩增，提取其DNA为模板，用目的引物和载体引物分别做PCR，分别得到约843?bp和1?340?bp片段，该转化子即为阳性克隆GS115(pGAPZoxa72)(图1);以不含oxa72的空质粒pGAPZαA电转化GS115作为对照，所得到的阳性克隆为GS115(pGAPZαA)，以此为模板用目的引物扩增时无特异性产物，用载体引物则可扩增出约540?bp的片段。用培养72?h的GS115(pGAPZoxa72)的蛋白浓缩提取物做Western blot可以得到单一的特异条带(图2)，这说明重组蛋白能特异地与抗HisTag抗体结合，而对照组GS115(pGAPZαA)则无特异条带。

　　2.4 头孢硝噻吩实验 分别滴加头孢硝噻吩后，含有oxa72基因的阳性克隆GS115(pGAPZoxa72)的菌体悬液和上清液均可在10?min内由淡黄色变为红色，而不含oxa72基因的阳性克隆GS115(pGAPZαA)及未转化的GS115菌株的菌体悬液和上清液均不变色(图3)，观察时间延长至半小时以上亦无改变，这表明，菌体和上清液中均有OXA72蛋白的表达，且所表达的OXA72碳青霉烯酶均有活性。

　　3 讨 论

　　不动杆菌属对碳青霉烯类抗生素的耐药机制复杂，产生碳青霉烯酶是其重要的耐药机制之一[4]。碳青霉烯酶按照Ambler分子分类可分为A、B、D 3类[5]，其中D类碳青霉烯酶即OXA型碳青霉烯酶，迄今共发现了40余种[610]。基因序列分析可把OXA型碳青霉烯酶分为八族[2]，常见的有两族:一族以OXA23和OXA27为代表,两者具有99 %的基因序列同源性;另一族以OXA24、OXA25、OXA26和OXA40为代表，具有98%的同源性;两族之间的同源性仅为60%。OXA72属于第二族，是由泰国首先报道的D型碳青霉烯酶。本研究从一名医院获得性肺炎患者的痰标本中分离的产OXA72的鲍曼不动杆菌菌株，是在我国首次发现[3]。该患者无出国旅游史，产生的OXA72可能是由于亲代基因发生突变所至。近年，Wang H[11]等在北京地区也发现了一株产OXA72的不动杆菌菌株，其他国家尚未见类似报道。

　　OXA72在细菌中表达量较少，没有特异性抗体，不易纯化，因此制备出纯化的OXA72是进一步研究OXA72的结构、性质及功能特点的前提。巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris, Pp)是单细胞真核生物，它既具有蛋白加工、折叠、翻译后修饰等高等真核表达系统的许多优点，又具有操作简单、快捷的原核表达系统的优点，而且它不产生有毒产物[12]，是表达外源蛋白的合适宿主，已有多种细菌、真菌和高等动植物基因在其中成功表达，如破伤风毒素C片段。本研究选用的表达载体pGAPZαA以组成型强启动子PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)为启动子[13],在发酵时不需甲醇等诱导条件,具有操作工艺简单、表达量高等优点;产物所携带的His标签也有利于产品的纯化和生产。

　　本研究成功地构建了OXA72的毕赤酵母表达载体，首次在酵母中表达了具有活性的碳青霉烯酶OXA72，获得了纯度较高的重组OXA72，有助于为进一步开展对OXA72的结构和功能的研究。

　　【参考文献】

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