以神经内肽酶为靶点筛选治疗阿尔茨海默症天然药物的实验研究

　　【摘要】 目的 筛选具有提高神经内肽酶(NEP)活性从而降低神经细胞β淀粉样肽(Aβ)水平的药物，为临床治疗阿尔茨海默症(AD)提供实验依据。方法 以脂质体LipofectamineTM2000介导瑞典突变型淀粉样肽前体蛋白(sweAPP)表达质粒pcDNA3.1sweAPP转染神经母细胞瘤细胞SKNSH，G418筛选获得稳定表达细胞株作为AD模型细胞，采用蛋白印迹技术检测sweAPP表达情况，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养基中Aβ40和Aβ42含量变化，进而以MTT法检测各天然药物对SKNSH细胞增殖能力的影响，确定药物的有效浓度及最佳作用时间，以NEP肽酶实验检测药物对NEP酶活性影响，ELISA法检测药物对Aβ水平的影响。结果 Western Blot结果显示，转染后SKNSH细胞高表达sweAPP蛋白;ELISA结果显示，转染后的SKNSH细胞分泌Aβ40、Aβ42明显升高，分别为转染前的7.26?和3.27倍(P<0.05)。NEP肽酶实验检测结果显示，茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3能够明显提高NEP酶活性,分别为(117±2.8)%、(131±4.0)%和(121±1.6)%。ELISA结果显示，经茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3作用后，细胞培养基中Aβ40和Aβ42水平明显降低，分别为对照组的(82±0.78)%和(85±2.21)%、(74±1.61)%和(99±3.31)%、(83±5.31)%和(76±6.74)%。结论 成功构建AD模型细胞;茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3可提高NEP酶活性，从而有效降低Aβ的水平;本研究为茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3在临床上的应用以及分子机制研究提供了试验数据。

　　【关键词】 神经内肽酶;β淀粉样肽;阿尔茨海默症;茶多酚;人参皂苷

　　YANG Lingling1, ZHANG Jing1, CUI Yunyan2, HU Xiaoyan1, KONG Feng1, CUI Xing1

　　(1. Institute of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2. Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China)

　　To obtain potential chemicals useful for chemotherapy of Alzheimer′s disease (AD) by screening naturally occurring compounds which could increase the Neprilysin (NEP) activity. Methods Neuroblastoma cells were cultured (SKNSH cells) and pcDNA3.1sweAPP was transfected into the SKNSH cells with LipofectamineTM2000, and G418 was used for screening. The stably transfected cells were confirmed with Western blot and enzyme linked immunosobent assay (ELISA). MTT was used to identify the optimal drug concentration and time. The effects of drugs on NEP activity were determined by the NEP peptidase assay, and the Aβ levels were determined by ELISA. Results Western blot results showed that SKNSH cells transfected with pcDNA3.1sweAPP highly expressed APP proteins, and ELISA results showed that Aβ40 and Aβ42 in culture media were significantly increased respectively by 7.26 and 3.27 fold after transfection. NEP peptidase assay showed that tea polyphenols, ginsenoside Rb1 and Rg3 could significantly enhance the NEP activity by 117±2.8%, 131±4.0% and 121±1.6% respectively. ELISA results showed that they could significantly decrease Aβ40 and Aβ42 in culture media of SKNSH cells by 82± 0.78% and 85±2.21%, 74±1.61% and 99±3.31% and 83±5.31% and 76±6.74% respectively. Conclusion The AD model cells were successfully constructed, and tea polyphenols, Ginsenoside Rb1 and Rg3 can effectively decrease Aβ40 and Aβ42 in culture media. Our findings offer potent theoretical supports for application of these drugs in treating AD.

　　Key words: Neprilysin; βamyloid peptide; Alzheimer′s disease; Tea polyphenol; Ginsenoside 阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一种原发性神经元退行性疾病，多发于老年人群。AD患者主要病理表现为脑内神经细胞间老年斑(senile plaque, SP)形成，神经细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)以及神经元的损伤及丧失[1]。β淀粉样肽(βamyloid Peptide, Aβ)是SP的主要成分，为39～43个氨基酸组成的多肽，由淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein, APP)经β、γ分泌酶次序降解产生[2]，Aβ异常增多，特别是Aβ40及Aβ42的累积，已经被确认是导致AD发生发展的关键因素[3]。

　　近年研究表明[4]，神经内肽酶(neprilysin, NEP)是体内催化Aβ降解的关键酶，是调节大脑Aβ水平的重要因素。因此，本实验构建了高表达瑞典突变型淀粉样肽前体蛋白(swedish mutant amyloid precursor protein, sweAPP)的神经母细胞瘤细胞作为AD细胞模型，以NEP为靶点，利用十余种已被证明对神经系统损伤有治疗作用的天然益智药物及抗氧化药物作为备选药物进行筛选，并在细胞水平检测了药物对Aβ的降解作用，以期为AD临床治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物 所有实验药物经化学检测，均为高纯度药物单体。大黄素、芦丁、槲皮素由山东大学药学院孙隆儒教授馈赠，维生素E、姜黄素购于Sigma公司，人参皂苷Rg1、Rb1、Rg3、Re购自中国药品生物制品检定所，葛根素、远志皂苷元、知母皂苷A3购自上海融禾医药公司，茶多酚购自无锡太阳绿宝科技有限公司。以上药品除芦丁、茶多酚溶于生理盐水，其余均溶于二甲基亚砜(DMSO),储存于-20?℃备用。

　　1.2 试剂 MEM培养基为Hyclone产品，胎牛血清购自Gibco公司，MTT、NEP酶切底物SucLAlaLAlaPhe7amino3methylcoumarin(SAAPAMC)、Aminopeptidase N(APN)、NEP酶抑制剂phosphoramidon购自Sigma公司，兔抗人APP购自CST公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自中杉公司，ECL发光系统为Pierce公司产品，Aβ40、Aβ42ELISA试剂盒为IBL公司产品。

　　1.3 方法

　　1.3.1 细胞培养 神经母细胞瘤细胞SKNSH购自中国科学院上海细胞所。细胞培养于含有10%胎牛血清的MEM培养基中，细胞长至80%～90%融合时1：3传代，用于实验。实验时将未经药物处理的细胞作为对照组。

　　1.3.2 sweAPPSK细胞株的构建 将细胞接种于24孔板，24h后细胞长至90%～95%融合，弃培基，用不含抗生素的OptiMEM冲洗2次, 按LipofectamineTM2000试剂操作说明，分别用不含抗生素的OptiMEM稀释质粒pcDNA3.1sweAPP(加拿大宋卫洪教授惠赠)和脂质体，5?min内将二者混合，室温孵育20?min后加入细胞中。继续培养细胞，于7?h后更换为完全培养基，24?h后1∶10传代，24h后更换含G418(400?μg/mL)的完全培养基，以后每48?h换液1次，3～4周后，可见单克隆细胞株出现，挑取单克隆继续培养并鉴定后命名为sweAPPSK细胞。细胞培养于含有400?μg/mL G418及10%胎牛血清的MEM培养基中，细胞长至80%～90%融合时1∶3传代，用于实验。

　　1.3.3 MTT检测药物毒性 将细胞以104/孔接种于96孔板，待细胞长至60%～70%融合时加入不同浓度的药物继续培养，培养时间为24、48、72?h。终止培养前4?h每孔加MTT(终浓度0.5?mg/mL)10?μL，4h后弃上清，每孔加100?μL DMSO溶解结晶物，混匀后于酶标测定仪检测其吸光度，检测波长为570?nm，参考波长630?nm。对照组除不加药物外其余处理与各实验组相同。每个样品浓度设定16孔。

　　1.3.4 Western blot检测sweAPP的表达 将sweAPPSK细胞接种于6孔板，培养至90%以上融合，弃上清，加入裂解液RIPA裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，10%SDSPAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜(160?mA，2?h)，5%脱脂奶粉封闭1?h，加入一抗，室温震荡杂交1?h后4?℃杂交过夜，TBST洗涤3次，加入二抗，室温震荡杂交1?h，TBST洗涤3次，TBS洗涤1次，ECL化学发光试剂盒检测结果，扫描保存。

　　1.3.5 NEP肽酶试验 NEP活性检测方法参照Bormann and Melzig等方法[5]。细胞培养于24孔板，经药物处理72?h后，弃培养基，每孔加入50?μL SAAPAMC(400?μmol/L)和400?μL TrisHCL缓冲液(pH 7.4)，37?℃孵育1?h后，加入50?μL phosphoramidon(50?μmol/L)。然后每孔取出400?μL液体转移至eppendorf管中，并于每管加入20?μL APN，56?℃孵育1?h后加入800?μL丙酮终止反应。根据底物产生的荧光强度分析NEP酶的活性。激发波长λexcit=367?nm,发射波长λemiss=440?nm条件下检测吸光度。根据试剂盒说明书绘制标准曲线计算NEP酶活性。

　　1.3.6 酶联免疫吸附试验(ELISA) 将细胞接种于24孔板，待细胞长至60%～70%融合时加药，每孔培基为400?μL，72?h后收取上清，分别加入Aβ40和Aβ42ELISA 试剂盒的96孔板中，100?μL/孔，4?℃孵育过夜，次日用Washing buffer洗9遍，加入二抗，100?μL/孔，4?℃放置1?h，Washing buffer洗10遍，加入显色底物，室温避光孵育0.5?h，加入终止液终止反应，酶标测定仪检测吸光度，检测波长为450?nm，根据试剂盒说明绘制标准曲线并计算浓度。实验时每种药物设3孔，重复2次。

　　1.4 统计学处理 实验数据以

　　2 结 果

　　2.1 sweAPPSK细胞株的构建及鉴定 为了更好的反映药物作用，本实验首先构建了sweAPPSK细胞以模拟AD患者脑内Aβ水平。经Western blot及ELISA对所构建细胞进行鉴定，结果显示，sweAPPSK细胞高表达APP蛋白(图1);另外，sweAPPSK细胞可产生更多的具神经毒性的Aβ40、Aβ42，其中Aβ40为未转染SKNSH细胞表达量的7.26倍，Aβ42为3.27?倍，见表1。表1 转染sweAPP后细胞分泌Aβ40及Aβ42的水平变化药物对SKNSH细胞增殖的影响 本实验采用MTT法通过检测药物对SKNSH细胞增殖能力的影响，确定药物作用的最佳剂量及作用时间。药物浓度梯度实验结果见表2(1～8)，最佳药物浓度分别为：茶多酚5?mg/L;维生素E 25?mg/L;槲皮素5?μmol/L;芦丁20?mg/L;大黄素4?mg/L;白藜芦醇5?μmol/L;姜黄素5?μmol/L;葛根素100?μmol/L;石杉碱甲5?μmol/L;人参皂苷Rg1 20?μmol/L;人参皂苷Rb1 50?μmol/L;人参皂苷Rg3 50?μmol/L;人参皂苷Re 50?μmol/L;远志皂苷元50?μmol/L;知母皂苷A3 1?mg/L。药物时间梯度实验结果表明，最佳作用时间为48～72?h。

　　2.4 茶多酚等药物对Aβ浓度的影响 由于茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3可明显提高NEP酶的活性，为此，本实验进一步验证这3个药物对Aβ40和Aβ42代谢的影响。ELISA实验结果显示，sweAPPSK细胞经茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3处理后，细胞培养基中Aβ40及Aβ42的浓度明显降低(P<0.01)，见表3。表3 茶多酚等对Aβ40及Aβ42水平的影响

　　3 讨 论

　　研究表明[3]，遗传、老化等原因可导致Aβ代谢平衡改变,引起脑组织内Aβ累积，最终启动AD病理过程。因此寻找有降低Aβ水平效能的药物对于AD的临床治疗有重要的意义。本实验选用了十余种益智中药有效组分如人参皂苷类、知母皂苷、芦丁、葛根素及典型抗氧化药物如茶多酚、维生素E、姜黄素等进行研究，以期能够找到有效的治疗AD的药物。

　　研究表明，在NEP基因缺陷小鼠脑内Aβ水平显著升高，其升高程度与NEP缺陷程度成正相关[6];而在转基因AD模型鼠脑中过表达NEP后，Aβ水平显著降低，呈剂量依赖性[78]。另有研究表明，AD患者在脑内易发生Aβ沉积、生成老年斑的海马、颞脑回等部位，表现为NEP的mRNA及表达产物含量减少，神经变性斑块部位NEP活性微弱[9]。这表明NEP在清除脑内Aβ过程中可能起重要作用，提示增加NEP表达及其活性可作为AD药物研究及临床治疗的新靶点。因此本研究选择NEP为靶点进行药物筛选，结果显示，茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3能够显著提高NEP酶活性。

　　为了模拟AD患者脑内神经元的改变并更准确有效地检测茶多酚、人参皂苷Rb1、Rg3对Aβ水平的影响，本研究利用脂质体法构建了高表达sweAPP的SKNSH细胞作为AD模型细胞，并命名为sweAPPSK细胞。经Western blot及ELISA试验鉴定，sweAPPSK细胞能够高表达APP,并使细胞外Aβ40及、Aβ42水平显著升高。进而，以高表达APP的神经母细胞瘤细胞为模型进行ELISA试验，结果显示，茶多酚5?mg/L、人参皂苷Rb1 50?μmol/L、人参皂苷Rg3 50?μmol/L能显著降低细胞外的Aβ40及、Aβ42。

　　茶多酚是茶叶的主要活性成分，具有抗氧化、抗诱变、神经保护、抑制肿瘤发生、降血脂等多种作用[10]。有研究表明[11]，茶多酚可升高NEP酶活性，因此，本实验选用茶多酚为阳性参照进行药物研究。人参皂苷是人参的主要活性成分，有神经保护作用，人参皂苷Rb1是其作用于神经系统的主要成分[12]，但人参皂苷Rb1对NEP酶活性的影响的研究鲜有报道，本研究发现人参皂苷Rb1可明显增强神经细胞NEP酶活性并可有效的降低细胞外Aβ40和Aβ42水平。人参皂苷Rg3，也是人参中重要成分之一，以往研究主要集中于其肿瘤抑制作用，但对其在神经系统疾病的作用特别是对阿尔茨海默症的治疗作用方面的研究甚少。本实验结果显示，人参皂苷Rg3能显著提高神经细胞NEP酶活性并能有效降低细胞外Aβ40和、Aβ42水平。

　　由于AD患者大脑Aβ累积过程复杂，涉及Aβ合成和分解途径相关的多种组分作用，尽管某些候选药物有明显降低Aβ作用，如维生素E，已被证实可以降低神经细胞Aβ，并已被用于AD的治疗，而本研究却显示维生素E可减少NEP表达，这与其他实验结果一致[1314]。提示这些药物可能通过不同作用靶点发挥作用，其机制值得更进一步探讨。

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