化淤理肺方对肺纤维化大鼠MMP2和TIMP1表达的影响

　　【摘要】 目的 探讨化淤理肺方对肺纤维化的干预作用和对MMP2/TIMP1表达的影响。方法 肺纤维化Wistar雄性大鼠84只,随机分成4组:中药组、激素组、模型组和对照组。所有大鼠第7、14、28天各处死7只。经HE染色评价肺组织肺泡炎和肺纤维化程度，免疫组化检测法检测MMP2与TIMP1的表达。结果 ① 肺泡炎、肺纤维化程度评价：模型组肺泡炎和肺纤维化程度较重,且胶原纤维沉积较多;中药组可见炎性细胞较少,肺泡结构基本正常,肺泡炎与肺纤维化较轻;激素组肺泡炎及纤维化与中药组相似。 ② MMP2蛋白的表达：中药组第7、14、28天较模型组表达明显减轻，于第14天达到高峰，此后降低，表达水平与激素组相似。③ TIMP1蛋白表达：中药组在这3个时段的表达均较对照组增高, 但均较模型组低，且呈逐渐升高趋势。结论 化淤理肺方能减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化,可能是通过调节MMP2、TIMP1途径起作用。

　　【关键词】 肺纤维化;化瘀理肺方;基质金属蛋白酶2;基质金属蛋白酶组织抑制物1;大鼠，Wistar

　　rats with bleomycininduced pulmonary fibrosis

　　WANG Qin1, LIU Shiqing2, LI Changsheng3, LU Wei4

　　(1. School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Department of Respiratory;

　　3. Department of Traditional Chinese Medicine; 4. Department of Pathology,

　　Qianfoshan Hospital, Shandong University, Jinan 250014, China)

　　To evaluate the effects and mechanism of Huayulifei on blemycininduced pulmonary interstitial fibrosis in rats. Methods Rats were randomly divided into the control group, the model group, the Huayulifei group and the hydrocortisone group. Rat pulmonary fibrosis was induced by blemycin(5?mg/kg) in the experimental groups and 0.9% saline in the control group. Rats were killed on the 7th，14th and 28th days. Expressions of MMP2 and TIMP1 proteins were determined by an immunohistochemical technique. Results ① The airsacculitis and fibrosis of lungs in the model group were fairly severe which had much deposition of collagen fibers. In the Huayulifei group which had few inflammatory cells, the alveoli structure was nearly normal, and most of the airsacculitis and fibrosis of lungs were mild. In the Hydrocortisone group, alleviation of airsacculitis and fibrosis of lungs were similar with those of the Huayulifei group. ② In the Huayulifei group, expressions of MMP2 protein and TIMP1 protein were significantly lighter than those in the model group. Conclusion Huayulifei can ameliorate blemycininduced pulmonary fibrosis in rats, and it may partly work by affecting the expression of MMP2/TIMP1.

　　Key words: Pulmonary fibrosis; Huayulifei; Matrix metallopeptidase2; Tissue inhibitor of metalloproteinase1; Rats, Wistar

　　间质性肺纤维化(interstitial pulmonary fibrosis,IPF)是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)代谢不平衡的结果。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)与组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是调节ECM 合成与降解的主要酶类。Conner[1]等认为,在纤维化形成过程中,MMPs在早期损伤阶段参与了细胞外基质和基底膜的降解，在疾病后期,MMPs表达相对于ECM的合成受到TIMPs (其表达高于MMPs)的抑制,导致ECM的沉积。本实验通过博莱霉素诱导肺纤维化模型大鼠,采用免疫组织化学法,观察肺纤维化肺组织中MMP2与TIMP1的动态变化,并进一步观察化淤理肺方对MMP2与TIMP1表达的影响,探讨其作用机制以指导临床用药。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠84只，体质量(200±20)g，由山东师范大学动物中心提供，动物合格证号为scxk(鲁)20050015。

　　1.1.2 实验药品 化淤理肺方颗粒(由丹参、半夏、当归、水蛭、黄芪、补骨脂、薏苡仁、鱼腥草、地龙等组成)由江阴天江药业有限公司生产，生产批号为0708222，用蒸馏水稀释至1?719?g/L浓度，高压灭菌，4?℃冰箱保存备用;注射用盐酸博莱霉素(15?mg/支)由日本药株式会社生产，产品批号为870700;氢化可的松琥珀酸钠(50?mg/支)由天津市生物化学制药厂生产，产品批号为20070304。

　　1.1.3 主要试剂及仪器 MMP2与TIMP1免疫组化试剂盒:北京博奥森生物技术有限公司提供。仪器:倒置显微镜(LEICADMIRB),德国莱卡公司制造;采用IPP5.0图像分析系统。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型制备 将大鼠麻醉,暴露气管, 一次性注入0.4%博莱霉素注射液0.25?mL(5?mg/kg),左右旋转鼠板,使博莱霉素注射液均匀分布于两肺,制成模型。

　　1.2.2 实验动物分组及给药方法 实验动物随机分为4组,每组21只,分组:对照组、模型组、激素组、中药组。对照组、模型组建模后第2天起每日予以2?mL/只生理盐水灌胃。中药组每日给予化淤理肺方药物2?mL/只灌胃，激素组每日给予氢化可的松琥珀酸钠腹腔注射(25?mg/kg)。

　　1.2.3 取材 各组分别在造模后第7、14、28天随机处死7只大鼠。1%戊巴比妥钠(35?mg/kg)腹腔注射麻醉后腹主动脉放血处死大鼠,开胸取肺组织,左肺经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,HE染色及免疫组织化学染色。

　　1.2.4 肺组织病理分析 肺组织经不同浓度酒精常规脱水、石蜡包埋、切片后,给予HE染色。根据Szapiel等[2]的方法评价肺泡炎和肺纤维化的程度。

　　1.2.5 免疫组化检测 MMP2与TIMP1的表达:大鼠肺组织用10%福尔马林固定,制成组织蜡块。按照北京博奥森生物技术有限公司提供SP试剂盒的操作程序进行, 脱腊至水后3%H2O2室温温育10?min,以灭活内源性过氧化物酶;热抗原修复,电炉加热温度达到92?℃维持15?min;5%BSA封闭液室温20?min;甩去多余液体,加入1∶100稀释的MMP2、1∶100TIMP1抗体(兔IgG), 4?℃过夜;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 37?℃ 20?min;滴加SABC试剂,37?℃ 20?min; DAB显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、树胶封片。结果经显微图像分析,以阳性颗粒的强度反映蛋白质表达水平。

　　1.2.6 表达结果判定 MMP2与TIMP1表达阳性结果的判定标准为:表达细胞的胞浆中出现棕黄色颗粒,颜色深表示表达强;如细胞中未出现棕黄色颗粒,则表达为阴性。

　　1.2.7 平均光密度测量方法 在图像分析系统上,400倍下,每张切片分别从4周和中间随机选取5个视野,测定肺组织内MMP2与TIMP1表达颗粒的吸光度,取其平均值作为该只大鼠的肺组织MMP2与TIMP1表达量。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件,结果以±s?表示。同一时间点的4个组进行单因素方差分析,并用q检验进行不同组间的两两比较，P<0.05?为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 组织病理形态学改变

　　2.1.1 临床观察 对照组:双肺外观无异常,表面光滑、饱满,呈粉红色。模型组:双肺体积缩小,表面凹凸不平,呈暗红色,边缘有点状出血,部分肺叶体积缩小,呈灰白色,表面有大小不等的灰白色结节。中药组、激素组与对照组相近,只有少数肺叶呈暗红色,边缘有点状出血及部分肺叶体积缩小。

　　2.1.2 光镜观察 对照组各观察点均无明显病变。模型组第7天可见肺野内多量炎性细胞，以淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞为主，可见少量成纤维细胞;第14天双肺炎性细胞较前增多，细胞成分相同,成纤维细胞、平滑肌细胞增殖,胶原纤维沉积,肺泡变形;第28天见双肺广泛纤维化,玻璃样变,细胞成分减少,肺泡大部分消失,但肺部炎性细胞浸润情况较前有所减轻。激素组、中药组肺泡炎程度同模型组比较有明显的减轻,第14天肺泡炎程度均达到高峰，此后较前减轻;肺纤维化程度较模型组也明显减轻，且中药组同激素组比较无统计学意义,肺纤维化的减轻程度有减缓的趋势，但同对照组比较仍较严重,见表1、2。

　　*2.2.2 TIMP1蛋白的表达 正常肺组织TIMP1在肺泡及间质巨噬细胞、 肺泡上皮、 支气管上皮细胞、 成纤维细胞及胶原染色均较浅。博莱霉素作用第7天后, 上述部位细胞染色有所增强, 第14、28天时增强较第7天更为显著。 中药组在这3个时段的表达均较对照组增高, 但均较模型组低， 见表4、 图2。 图1 第28天时MMP2蛋白表达(棕黄色颗粒，SABC，×100)

　　3 讨 论

　　目前,临床上对肺纤维化疾病的治疗除非特异性抗炎、免疫抑制剂及糖皮质激素等方法外,国内学者试图运用中药治疗肺纤维化并已取得一定疗效,其中尤以活血化淤中药研究最多。

　　本研究在原有中药防治肺纤维化理论的基础上,深入研究肺纤维化发病机制,认为其基本病机为“肺肾虚损,痰瘀阻络”,以“活血化淤,祛痰理肺,畅利气机”为治则组成化淤理肺方。本实验通过对MMP2及TIMP1的检测阐明其对肺纤维化的干预作用。近年研究发现，MMPs、TIMPs与肺纤维化密切相关[34],这为肺纤维化的研究提供了一个新突破点。各种肺纤维化的共同病理表现均为细胞外基质的代谢紊乱。MMPs是20世纪90年代发现的一类含锌的蛋白水解酶,其主要作用是降解细胞外基质。TIMPs是MMPs的特异性抑制剂, 与MMPs特异性结合,并使之失活,直接参与细胞外基质的代谢[5]。在肺纤维化中, 并非MMPs、TIMPs家族中的所有成员都同等重要,有研究证实,MMP2与TIMP1的比例失衡是肺纤维化发生、发展的关键。在肺纤维化的初期,即肺泡炎阶段,MMP2/TIMP1比例增加,其降解作用增强,造成肺组织的损伤,触发肺纤维化[67];在后期即纤维化阶段, MMP2/TIMP1比例下降,其降解作用减弱,基质沉积增加,形成稳定的肺纤维化[8]。本实验中的模型组也体现出同样的趋势。基于MMPs及TIMPs在肺纤维化病理过程中的重要作用,寻求它们之间的平衡已成为干预肺纤维化形成的途径之一。

　　本实验结果显示，在气管内注入博来霉素后第14天,大鼠肺内病理表现以肺泡炎为主, 肺组织内MMP2表达明显增高。到第28天,肺内病理主要表现为纤维化,此时肺组织内MMP2表达下降但仍高于正常。这说明MMP2在肺泡炎症的过程中起重要作用,这种作用可能与基底膜的损伤有关,而MMP2则有可能通过对肺上皮基底膜的反复破坏参与肺纤维化的发生。化瘀理肺方在某种程度上抑制了MMP2的活化,减轻了炎症期的损伤。TIMP1在第7天时表达都很弱, 第14、28天时,表达逐渐增强，经中药和西药治疗的明显比模型组表达减弱,中药与西药治疗效果无明显差异,提示化瘀理肺方的作用环节可能是在肺纤维化发展过程中,抑制了TIMP1在肺内的异常高表达,从而减轻了TIMP1对MMPs的抑制,相对提高了MMPs的活性,使纤维化MMPs/TIMPs比例失衡得以恢复,间接地起到了降解ECM作用。

　　因此，本研究认为，化瘀理肺方对肺纤维化的干预作用是它能在各个时段对MMP2和TIMP1的表达量进行调整, 从而使MMPs/TIMPs趋于平衡,延缓甚至抑制纤维化的进程。

　　【参考文献】

　　[1] Connor C M O, FitzGerld M X. Matrixmetallop roeases and lung disease[J]. Thorax, 1994, 49:602609.

　　[2] Szapiel S V, Elson N A, Fulmer J D, et al. Bleomycininduced in 2 terstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse[J]. Am Rev Respir Dis, 1979, 120(4):893899.

　　[3] Tan S Z， Liu C H， Zhang W, et al. Effects of Fuzheng Huayu recipe on MMP2 activity and type IV collagen expression at fibrotic lung[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi， 2007， 32(9)：835839.

　　[4] Oggionni T， Morbini P， Inghilleri S， et al. Time course of matrix metalloproteases and tissue inhibitors in bleomycininduced pulmonary fibrosis[J]. Eur J Histochem， 2006， 50(4)：317325.

　　[5] Manoury B， CauletMaugendre S， Guénon I， et al. TIMP1 is a key factor of fibrogenic response to bleomycin in mouse lung[J]. Inter J Immunopathol Pharmacol， 2006， 19(3)：471487.

　　[6] Kong L， Pan Y， Yu H F, et al. Changes of matrix metalloproteinases activities in pulmonary fibrosis rats[J]. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao， 2006， 28(5)：717720.

　　[7] 马万里,李元桂,辛建保. 基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制剂在肺纤维化中的变化[J]. 华中科技大学学报:医学版,2002,31(5):527529.

　　[8] Selman M, Ruiz V, Cabrera S, et al. TIMP1,2,3,and 4 in idiopathic pulmonary fibrosis. A prevailing nondegradative lung microenvironment[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2000, 279(3):562574.