颈脊髓损伤后大鼠水钠代谢紊乱动物模型的建立

　　【摘要】 目的 建立大鼠颈脊髓损伤后水钠代谢紊乱的动物模型。方法 在预实验基础上选成年雌性Wistar大鼠45只，随机分为正常饲养无手术对照组(A组)15只，肠内营养乳剂(TP)喂养并行胃造瘘和颈后路椎旁肌剥离手术对照组(B组)15只，肠内营养乳剂喂养并行颈脊髓完全横断损伤及胃造瘘术、导尿术实验组(C组)15只，其中C组3只鼠术后死亡弃用，测量血钠、尿钠浓度及尿量。结果 与B组相比，C组于手术4?d后均获得明显低钠血症(P<0.05)。A组和B、C组术前血钠浓度无明显差异(P>0.05)。 结论 大鼠颈脊髓完全损伤后引起低钠血症的发生，可以作为颈脊髓损伤并发低钠血症动物模型进行深入研究。

　　【关键词】 脊髓损伤;代谢; 模型，动物; 大鼠，Wistar

　　LIU Yang, JIA Tanghong, GONG Weiming, NING Bin, GUO Shuya,

　　SONG Hongliang, XU Peng, ZHANG Tao, ZHANG Laibo

　　(Department of Orthopaedics, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China)

　　To establish a rat model of cervical spinal cord injury(SCI) for exploring the mechanism of metabolic disturbance of water and sodium after cervical SCI. Methods Fortyfive female adult Wistar rats were randomly divided into three groups: fifteen in group A were fed with normal rodent food without surgeries (the control group), fifteen in group B were fed with enteral nutritional emulsion(TP) and subjected to gastrostomy after lesions of the paravertebral muscles (the sham group), and fifteen in group C were fed with TP and subjected to gastrostomy after cervical spinal cord transaction (SCT) and urethral catheterization (the experimental group). The urine volume and concentration of sodium in blood and urine were determined. Results Compared with group B, group C had hyponatremia four days after the operations (P<0.05). Blood sodium concentration was not obviously different between group A and groups B and C preoperatively(P>0.05). Conclusion Hyponatremia happens after cervical spinal cord injury in rats.

　　Key words: Spinal cord injury; Metabolism; Models, animal; Rats, Wistar

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 血液生化分析仪(Chiron 348; Chiron Diagnostics Corp.; MA, USA);瑞素肠内营养乳剂(Enteral nutritional emulsion，TP)、医用硬膜外麻醉导管、医用静脉输液器，由华瑞制药有限公司提供;成年健康Wistar大鼠，由山东大学实验动物中心提供。

　　1.2 动物模型建立

　　1.2.1 实验分组 选用由山东大学实验动物中心提供成年健康雌性Wistar大鼠45只，体质量(290±10)g。室温23?℃普通笼养，12?h交替昼夜环境。随机分为3组。A组15只为无手术对照组。选用普通笼养，给予不限量标准鼠粮与纯净水喂养1周，无任何手术干预。B组(手术对照组)15只与C组(实验组)15只大鼠均饲养笼单只饲养。 每只每日给以60?mL　TP喂养，均能完全摄入。喂养2?d后，大鼠大便由颗粒状改变为粘稠糊样，每日不超过5?mL。均于TP喂养后第8?d进行手术干预。手术时间选在需再次给予TP喂养前，此时大鼠相对空腹。

　　1.2.2 实验方法

　　1.2.2.1 颈脊髓横断术 本实验均采用40?mg/kg戊巴比妥腹腔内麻醉，麻醉后大鼠俯卧于操作台，胸下被垫起，使其颈胸段脊柱后凸。大鼠颈后正中入路，体表触摸骨性标志，自上而下第一枚明显凸起棘突为胸2棘突。以它为标志向头端剥离并牵开椎旁肌，暴露颈6、7棘突椎板，向后提起颈7棘突，颈6、7棘突椎板间隙即张开，此时硬脊膜充分暴露，用11号手术刀在该平面进入椎管内完全离断颈脊髓。 此时鼠尾痉挛性摆动，双下肢回缩性扑动，随后呈迟缓性瘫痪。严密缝合颈后肌肉和皮肤，防止脑脊液漏。C组大鼠完成颈脊髓损伤手术，B组大鼠仅行硬脊膜暴露不损伤颈脊髓，完成对照手术。

　　1.2.2.2 胃造瘘术 用人静脉输液器截去针头作为造瘘管，其尾部接口可与注射器乳头相衔接。B组和C组大鼠匀依Waynforth HB.和Flecknell PA.法[6]行胃造瘘术。造瘘管自不易被鼠咬到的背部皮肤穿入腹腔内，并在皮肤穿入处缝合固定。麻醉苏醒后大鼠单只笼养。每日仍为TP 60?mL喂养量，用注射器分次通过造瘘管缓慢注入胃内，每次喂养量不超过10?mL。喂养时如大鼠出现吞咽反射需停止注入。喂养后用血管夹夹闭造瘘管，防止TP外漏。推荐两次喂养最短间隔2?h。TP需加温约至30?℃，防止过凉物直接进入胃肠道。术前1?d和手术当天TP内添加口服抗生素头孢氨苄胶囊剂100?mg/(kg·d)?预防感染。

　　1.2.2.3 导尿术 医用硬膜外麻醉导管作为导尿管，向大鼠尾端牵拉尿道外口，使尿道耻骨下弯顺直，导尿管贴尿道后壁进入膀胱，可见有尿液导出。如遇阻力，忌用暴力，以免造成假道，可压迫膀胱区，使尿道括约肌扩张便于尿管进入。硬膜外麻醉导管自身有刻度，管头顶及膀胱壁时，尿道口显示刻度4～5?cm,缝合固定导尿管于尿道口。仅C组大鼠行导尿术，收集并记录24?h尿量。

　　1.2.3 检测 A组于普通喂养1周后，鼠尾取血测血钠浓度。B组和C组于麻醉后、手术前鼠尾取血测血钠浓度。C组于术后第4个24?h尿量记取完成后鼠尾取血送检血钠，B组于术后相同时刻鼠尾取血送检血钠。C组精确记录每24?h尿量，并取样送检每24?h平均尿钠浓度。B组按动物代谢笼的方法粗略收集术后尿液并记录尿量，取样送检尿钠。实验后大鼠CO2法处死并尸检。C组行损伤脊髓病理检查。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，数据以

　　2 结 果

　　C组3只鼠于术后当日出现陈式呼吸，心脏穿刺取血后死亡，血液检测与术前血钠无明显变化后，此3只鼠自C组排除。B、C两组大鼠手术前后血钠浓度差值对比有明显差异(P<0.05)，表明颈脊髓完全横断损伤干预后的C组大鼠于手术4d后均获得低钠血症，见表1。A组和B组、C组术前血钠浓度无明显差异(P=0.185>0.05)。C组术后经留置导尿准确计量尿量，自第2个24?h尿量均大于35?mL，最高达50?mL。C组大鼠24?h平均尿钠浓度检测显示有7只大鼠4?d均高于40?mmoL/L，另外5只呈现逐步升高，最高56?mmoL/L,与B组术后非精确尿计量相比，C组术后观察到过量尿钠流失(P<0.05)。C组大鼠处死后，损伤脊髓病理均明确观察到颈脊髓横断损伤。B组和C组大鼠处死后尸检均未发现胃造瘘口渗漏现象。 表1 手术前后B组和C组大鼠血钠浓度变化

　　3 讨 论

　　颈脊髓损伤并发低钠血症是困扰临床治疗的一大难题，发病机理尚不明确，主要有两种学说：抗利尿激素分泌异常综合征和脑耗盐综合症[12]。学术界一直存在争论，目前没有一个确定性理论来解释这一临床现象。相关研究均来自临床资料，至今尚未开展实验研究[7]。 本实验尝试运用杂食性动物大鼠作为研究对象，建立颈脊髓横断损伤模型。以符合大鼠生理需要量为基础，通过胃造瘘肠内营养乳剂支持营养和尿管导尿，量化大鼠出入水量及钠量， 观察大鼠血钠、尿钠、尿量变化。通过A组和B组对照，排除肠内营养乳剂和胃造瘘术对C组血钠的干扰，3组间进行数据对比，得出C组阳性结果，初步建立了颈脊髓损伤后可供水钠代谢研究的动物模型。

　　颈脊髓损伤程度与低钠血症发生率呈正相关，张立等[2]报道Frankle A型颈脊髓损伤发生低钠血症率可达100%，故本实验研究首先选用Frankle A型颈脊髓损伤模型，以提高实验阳性率。 该动物模型需麻醉后留取大鼠血样，然后损伤颈脊髓，再进行胃造瘘，最后还需留置导尿管。任何多余的损伤、出血、延长手术及麻醉时间，均影响术后大鼠的生存和实验的准确性。根据大鼠脊柱骨骼解剖学特点，本实验改良脊髓横断损伤方法[8]。该方法定位准确，不需暴露更多脊椎节段，不需切除椎板，手术损伤小、出血量少;用11号手术刀沿大鼠颈6、7棘突椎板间隙进入，横断该平面颈脊髓，操作简单、手术时间短。此方法需严密缝合椎旁肌，防止脑脊液渗漏及局部血肿发生。本实验后期脊髓病理检查均证实脊髓完全横断。颈6、7棘突椎板间隙平面脊髓损伤对大鼠颈部活动和双前肢功能无明显影响，大鼠术后呼吸循环抑制现象发生少，长期生存率高。

　　TP每mL热量为1kcaL。 每日60?mL　TP提供钠量0.045?g，蛋白2.28?g，及其他均衡营养成分，可以满足成年大鼠生理维持需求[9]。TP与标准鼠粮相比，缺乏粗纤维。预实验中，通过长时间TP喂养大鼠，大鼠大便性状改变为粘稠糊样，每日不超过5?mL,无腹泻发生，喂养后无电解质紊乱发生，提供了大鼠经胃造瘘TP喂养的可行性。脊髓损伤后，大鼠经胃造瘘TP喂养也得到相同大便性状和排便量。预实验中，由于过快大量注入TP，可使大鼠胃内压力突然升高，可直接造成胃造瘘口外渗营养液至腹腔，形成腹膜炎，故需缓慢注入TP避免上述危险。推注时，以大鼠出现吞咽反射为胃内压过高表现，需停止注入TP。依据本实验推荐每次经造瘘管注入TP量不超过10?mL;两次推注TP间隔时间应超过2?h，间隔时间过短，鼠胃尚未排空，松开造瘘管夹，可见胃内容物自造瘘管反流;大鼠麻醉未清醒时，不建议进行胃内推注，预实验中发生TP食管反流误吸至大鼠死亡个例;TP注入前需加温，鼠胃冷刺激可影响大鼠术后存活。在预实验中，由于观察到行胃造瘘术5?d后有个别大鼠胃造瘘口渗漏现象，同时更长时间观察大鼠术后血钠变化将受到大鼠死亡率增高的影响，因此本实验均于术后4?d终止。终止后大鼠尸检，均未见大鼠胃造瘘口外渗TP现象。

　　低钠血症和水、钠代谢密切相关，应用胃造瘘TP喂养和大鼠留置导尿，可准确统计出入水量和进出钠量，是本实验研究的关键。医用硬膜外麻醉导管头端圆钝有多个引流孔，直径适合大鼠尿道，便于经尿道导入膀胱并引流尿液。预实验中，由于雄性大鼠尿道细长，导尿术不易操作，易导出假道,结合他人经验[10]，本实验弃用雄性大鼠，均采用便于导尿的雌性大鼠。C组大鼠通过留置尿管，精确地计量尿量及尿钠浓度，所获数据与B组数据及大鼠生理指标相比，存在过度钠流失[9]。但由于B组大鼠是按动物代谢笼的方法来收集术后尿液，尿计量不够精确，尿液易受鼠便污染，所获结果及相关统计学分析结果仅供参考，我们未给出定性结论，或许C组大鼠于术后第4?d获得低钠血症与尿钠过度流失有关。因此，如何完善B组大鼠尿计量的精确性，明确C组大鼠是否存在过量尿钠流失，进而导致低钠血症，仍有待实验进一步完善。

　　本实验结果显示，A组与B、C组术前血钠浓度对比，无统计学差异，且与大鼠生理指标相符[9]。B组和C组大鼠术前后血钠浓度差值对比，存在明显统计学差异，证实颈脊髓损伤后大鼠血钠浓度有明显减低。本实验初步建立了颈脊髓损伤并发低钠血症的动物模型，为以后动态观察颈脊髓损伤后血钠浓度变化，进而明确低钠血症发生机理打下基础。同时，颈脊髓损伤后大鼠水钠代谢长期变化，也可利用此模型进一步研究。本实验首创了颈脊髓损伤并发低钠血症大鼠模型，所用方法均是成熟实验技术[6,8,10]，所获结果与临床观察结果相一致，可以作为颈脊髓损伤并发水钠代谢紊乱的动物模型进行深入研究。

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