膀胱移行细胞癌中Survivin表达的意义

　　【摘要】 目的 探讨膀胱移行细胞癌(TBCC)中Survivin表达的意义。方法 应用免疫组织化学一步法、RTPCR法检测40例BTCC和12例正常膀胱粘膜中Survivin和Survivin mRNA的表达，Western blot方法检测40例BTCC与32例非BTCC患者尿液细胞中Survivin的表达。结果 免疫组织化学方法显示，Survivin在BTCC中阳性表达率为95.0%，在正常膀胱粘膜中无表达(P<0.01)。RTPCR显示，Survivin mRNA在BTCC中阳性表达率为100.0%，在正常粘膜中无表达(P<0.01)。Western blot显示，Survivin在BTCC患者尿液细胞中阳性表达率为95.0%，在非BTCC患者中无表达(P<0.01)。3组中Survivin的表达与BTCC的分级、分期密切相关(P<0.01)。结论 Survivin在BTCC中高表达，因而可作为BTCC的一个良好的诊断和预后指标。

　　【关键词】 膀胱肿瘤;凋亡抑制蛋白;存活素

　　(1. Department of Urology, Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211， China;

　　2. Department of Urology, Jinan Fifth People′s Hospital, Jinan 250022, China;

　　3. Department of Urology, Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China)

　　To explore the significance of Survivin expression in bladder transitional cell carcinoma (BTCC). Methods Immunohistochemical (IHC) onestep method and RTPCR method were used to determine the expression of Survivin and Survivin mRNA in BTCC (n=40) and normal bladder mucosa (n=12); Survivin was investigated using the Western blot analysis in urine specimens or exfoliated urine cells (EUC) in BTCC (n=40) and nonBTCC (n=32). Results IHC indicated that expression level of Survivin in BTCC was 95.0% (P<0.01), RTPCR indicated that expression level of Survivin in BTCC was 100.0%(P<0.01), and Western blot indicated that expression level of Survivin in BTCC was 95.0%(P<0.01). Survivin was not expressed in normal bladder mucosa. Expression level of Survivin was strongly correlated with pathological grade and clinical stage (P<0.01). Conclusion Survivin highly expresses in BTCC, suggesting that Survivin should be a good diagnostic and prognostic index of BTCC.

　　Key words: Bladder neoplasms; Inhibitor of apoptosis protein; Survivin检测尿液中Survivin对诊断BTCC有较高的敏感性与特异性，本研究分析患者BTCC组织和尿液中Survivin与临床病理参数的关系，旨在探讨Survivin在BTCC中表达的意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 选取天津医科大学第二医院泌尿外科2003年12月至2005年12月手术切除的40例BTCC组织和12例正常膀胱粘膜。40例BTCC中，男30例，女10例;44～86岁，平均64岁。其中，单发肿瘤8例，多发32例;原发肿瘤9例，复发31例。按照WHO2004年“膀胱肿瘤组织学分类”标准分级：低分级9例，高分级31例;TNM分期：Ta～1 8例;T2～432例。原发肿瘤患者术前均未行放疗、化疗和免疫治疗，复发患者术前常规行羟基喜树碱(北京双鹭药业股份有限公司，批号：H20053666)灌注(羟基喜树碱20?mg溶解于生理盐水60?mL，注入膀胱腔内)直至复发。正常膀胱粘膜为前列腺开放性手术时留取，均为男性，54～76岁，平均65岁。组织标本切取后保存于-70?℃的冰箱中。留取此组BTCC患者术前3次晨尿;另选取天津医科大学第二医院泌尿外科同期32例非BTCC患者晨尿作为对照(其中前列腺增生16例，腺性膀胱炎6例，结石3例，膀胱炎4例，肾癌3例)，36～78岁，平均63岁，其中男22例，女10例。取患者晨尿尿液约50?mL，低温离心尿脱落细胞(3?000?r/min, 10?min)，留取尿脱落细胞保存于-20?℃的冰箱备用。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)一步法检测患者膀胱组织中Survivin的表达 一抗Survivin为兔抗人多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，Survivin一抗稀释度为1∶80。其余试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实验步骤按试剂说明书进行。已知基因表达组织片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.2.2 RTPCR方法检测患者膀胱组织中Survivin mRNA的表达 Trizol试剂盒(美国Invitrongen公司)，RTPCR试剂盒(TaKaRa大连宝生物工程有限公司)。Survivin和内参GAPDH引物由北京奥科公司设计并合成，片段长度分别为243、450?bp。其中Survivin上游引物序列：5′GGACCACCGCATCTCTACAT3′，下游引物序列：5′GACAGAAAGGAAAGCGCAAC3′;GAPD上游引物序列：5′GGATGCCTTTGTGGAACTGT3′，下游引物序列：5′GGTGCTTGGCAATTAGTGGT3′。根据Trizol试剂盒说明书提取组织总RNA，测定RNA纯度;采用RTPCR试剂盒生成DNA片段。Survivin反应条件：50?℃逆转录15?min，94?℃预变性2?min;94?℃变性30?s，61?℃退火30?s，72?℃延伸55?s，30个循环;72?℃延伸7?min。GAPDH反应条件：50?℃逆转录15?min，94?℃预变性2?min;94?℃变性30?s，58?℃退火30?s，72?℃延伸55?s，30个循环;72?℃延伸7?min。

　　1.2.3 Western blot方法检测患者尿脱落细胞中Survivin的表达 Survivin兔抗人多克隆抗体、SABC检测试剂盒等均购自武汉博士德生物工程有限公司。Survivin一抗稀释度为1：300。按Western blot 试剂盒说明书操作。

　　1.3 结果判定

　　1.3.1 IHC一步法结果 在组织切片中Survivin阳性细胞表现为胞浆染为黄色。每张切片至少观察5个视野并计数100个细胞。结果判定标准：阳性细胞数≥10%为阳性，阳性细胞数<10%或染色强度与背景相比无明显差异视为阴性。

　　1.3.2 RTPCR结果 RNA电泳显示5、18、28S条带清晰，提示RNA纯度好。DNA电泳有243?bp特异性片断为阳性，无特异性片断为阴性。于Kodak440分析系统上分析灰度密度，并与内参相比较以求半定量。

　　1.3.3 Western blot结果 在硝酸纤维素膜上，有分子量约16.5?KD的特异蛋白条带出现为阳性，无特异性条带出现为阴性。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件，样本率的比较采用校正的χ2检验及Fisher′s确切概率法，样本均数的比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同种类的膀胱组织中Survivin和Survivin mRNA的表达 见表1。Survivin在BTCC中表达率为95.0%，在正常粘膜中呈阴性表达，差异有统计学意义(P<0.01) 。BTCC中Survivin表达仅与病理分级、分期有关(P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤数目等临床病理参数无关(P>0.05)。凝胶电泳成像可见，Survivin mRNA(243?bp)和GAPDH mRNA (450?bp)特异性条带清晰，其中内参GAPDH mRNA在BTCC和正常膀胱粘膜中均有表达，且表达量大致相等;而Survivin mRNA仅在BTCC组织中有表达，在正常粘膜中无表达(P<0.01);经定量分析后，其表达量仅与肿瘤病理分级、分期有关(P<0.05，见图1，图2)。

　　2.2 BTCC患者尿脱落细胞中Survivin的表达 见表1。40例BTCC患者尿液中，38例Survivin阳性，阳性率为95.0%(这与IHC结果完全一致);而在32份非BTCC患者尿液中无1例阳性，两组中Survivin表达的差异有统计学意义(P<0.01，见图3)。在40例BTCC患者尿液中，Survivin阴性表达的两例为低级、低期肿瘤。尿液中Survivin的表达仅与肿瘤分级、分期有关(P<0.05)，与其他临床病理参数无关(P>0.05)。Survivin mRNA琼脂糖凝胶电泳

　　3 讨 论

　　Survivin是IAPs家族中最强的抑制凋亡蛋白之一，具有调节细胞周期、抑制细胞凋亡的作用。它在终末分化的成熟组织(除胸腺、生殖腺外)中基本无表达，而在胚胎发育及人的肿瘤组织中(包括胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等)表达。它通过经典的Caspase途径和促进细胞分裂途径，阻止细胞凋亡[1]。

　　肿瘤组织内Survivin的表达具有普遍性，BTCC中存在着Survivin的高表达。Kitsukawa S等[4]用定量PCR方法检测BTCC中Survivin mRNA的表达，12例肿瘤患者中7例尿液细胞中有Survivin mRNA的表达，所有肿瘤组织均表达Survivin mRNA，肿瘤组织中Survivin mRNA的表达与肿瘤分级、分期有关，提示Survivin可作为BTCC早期复发的一个预后指标。Gonzalez S[5]通过对30例pT1G3尿路上皮肿瘤的研究，认为Survivin表达与肿瘤局部浸润密切相关，联合P53检测能在早期识别浸润性肿瘤。研究显示, Survivin及其mRNA在BTCC中选择性地高表达，且其表达水平与肿瘤的分级、分期、复发等预后指标密切相关[47]。

　　本研究采用免疫组织化学一步法、RTPCR方法和Western blot方法检测BTCC患者肿瘤组织和尿液中Survivin的表达，并分析Survivin表达与临床病理参数之间的关系。结果显示，Survivin和Survivin mRNA的表达仅与肿瘤分级、分期有关，与文献报道一致[4,6]，提示Survivin在BTCC发生和发展中起重要作用，也为选择Survivin作为靶基因治疗BTCC提供了理论依据[8]。BTCC患者尿液中Survivin与肿瘤组织中Survivin表达高度一致，说明检测尿脱落细胞Survivin的表达能很好地反映肿瘤组织Survivin的表达情况，尿液中Survivin的检测可作为BTCC辅助诊断、预后检测的一种非侵袭性方法。由于尿脱落细胞中Survivin的表达具有较高的敏感性和特异性，使其非常适合于BTCC的诊断与随访，联合尿细胞学检查更可提高检测灵敏度[9]。

　　综上所述，Survivin在BTCC中高表达，其表达与肿瘤分级、分期有关，因而Survivin可作为BTCC的一个良好的诊断和预后指标。鉴于本组数据较小且浸润性肿瘤较多，BTCC中Survivin表达与临床病理参数之间的关系和尿脱落细胞中Survivin的预后价值尚需进一步深入研究。

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