罗格列酮对高脂饲养大鼠骨骼肌AMPK活性的影响

　　【摘要】 目的 观察罗格列酮对高脂饲养大鼠骨骼肌AMP激活的蛋白激酶(AMPK)α、葡萄糖转运体4(GLUT4)、胰岛素受体底物1(IRS1)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的影响，为临床有效的预防和控制脂毒性提供科学依据。方法 雄性Wistar大鼠30只，随机分为对照、高脂和高脂加罗格列酮[1?mg/(kg·d)]三组，每组10只。喂养5个月后，采用Real time PCR法测定大鼠骨骼肌中AMPKα1、AMPKα2、GLUT4的mRNA水平，RTPCR法测定IRS1、PPARγmRNA的表达，Western blot法测定PAMPK、TAMPK和GLUT4的含量。结果 高脂组大鼠除AMPKα1和IRS1的mRNA表达无变化外，AMPKα2、 GLUT4、PPARγ的mRNA水平及PAMPK、TAMPK、 GLUT4的蛋白水平均比对照组降低(P<0.01或P<0.05)。与高脂组相比，罗格列酮显著增加大鼠骨骼肌GLUT4、PPARγ、IRS1的mRNA水平及 PAMPK、GLUT4的蛋白水平(P<0.01或P<0.05), 而对AMPKα1、AMPKα2的mRNA水平和TAMPK的蛋白水平无明显影响。结论 罗格列酮可增加高脂喂养大鼠的骨骼肌PAMPK、GLUT4、PPARγ和IRS1的表达，提示其具有参与改善胰岛素抵抗、缓解脂毒性的作用。

　　【关键词】 罗格列酮;蛋白激酶，AMP激活;高脂;大鼠，Wistar

　　in the skeletal muscle of highfat fed rats

　　SUN Ying1，2， LIU Yi3，　ZHANG Jie2，　CUI Bin2，　KONG Lei1，　ZHAO Jiajun1

　　(1. Department of Endocrinology; 2. Central Laboratory; 3. Department of

　　Respiratory, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China)

　　To investigate effects of Rosiglitazone on activities of AMPK (AMPactivated protein kinase)，GLUT4 (glucose transport 4)，IRS1 (insulin receptor substrate 1)， and PPARγ (peroxisome proliferator activated receptor γ) in the skeletal muscle of highfat fed rats. Methods Male Wistar rats were randomly divided into three groups：the control group (N, n=10), the highfat diet group (HF, n=10), and the Rosiglitazonetreated group (HF+Ros，n=10). After a high fat feeding for four months, rats in the HF+Ros group were treated with Rosiglitazone at a dose of 1?mg/(kg·d) orally for one month. Skeletal muscles of all animals were gained for further analysis. The mRNA levels of AMPKα1, AMPKα2, and GLUT4 were determined using real time PCR and of IRS1 and PPARγ using RTPCR. Protein levels of total AMPK, PAMPK, and GLUT4 were determined by Western blot. Results Compared with the controls, the mRNA levels of AMPKα2, GLUT4, and PPARγ were reduced, and also protein expressions of total AMPK, PAMPK and GLUT4 were decreased in rats with a highfat diet. But the AMPKα1 and IRS1 mRNA levels had no changes. Compared with the HF group, Rosiglitazone increased mRNA levels of GLUT4, PPARγ and IRS1 and enhanced protein expressions of PAMPK and GLUT4. But there were no changes in AMPKα1, AMPKα2, and TAMPK. Conclusion Rosiglitazone could increase expression of PAMPK, GLUT4, PPARγ, and IRS1 in highfat fed rats, which suggests that it could ameliorate insulin resistance.

　　Key words： Rosiglitazone; AMPactivated protein kinase; Highfat; Rats，Wistar

　　长期高脂饮食可以造成胰岛素抵抗和胰岛功能异常，即所谓的脂毒性。高脂环境能损害包括骨骼肌、肝脏和脂肪在内的多种胰岛素靶器官的胰岛素敏感性。因此高脂饮食已经成为诱发胰岛素抵抗(IR)的独立危险因素之一。高脂环境诱导的胰岛素抵抗可伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常。AMP激活的蛋白激酶(AMPactivated protein kinase，AMPK)是近年发现的一种细胞内能量代谢的重要调节因子，被称为“细胞能量调节器”。此外，AMPK还参与了机体胰岛素敏感性的调节。AMPK是一个由α、β、γ三种亚基构成的异源三聚体，α为其催化亚基，有αl, α2, α3三种亚型，β和γ均为调节亚基。磷酸化的AMPK(PAMPK)是AMPK的活化形式。罗格列酮是近年应用的一种噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，能显著改善胰岛素抵抗及相关代谢紊乱。但其作用机制目前尚未完全明确。本研究拟通过观察罗格列酮对高脂大鼠AMPK、葡萄糖转运体4(glucose transport 4，GLUT4)、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)表达的影响，旨在为进一步探讨其作用机制提供部分理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠30只，体质量180～200?g，由山东省卫生防疫站提供。适应性喂养1周，随机分为两组。对照组(N组)10只，给予大鼠食用的标准饲料,其中碳水化合物热卡占61%，脂肪热卡占11%;高脂组(HF组)20只，给予高脂饮食，脂肪热卡占59%，以饱和脂肪酸为主。高脂组4个月后再随机分为高脂组和高脂加罗格列酮组(HF+ROS组)，各10只。HF组继续高脂喂养。HF+ROS组于第5个月开始，在高脂喂养的同时加用罗格列酮1?mg/(kg·d),持续1个月。各组大鼠每日膳食热量控制在310?KJ/只，喂养期均为5个月。

　　1.2 药品与试剂 罗格列酮由葛兰素史克有限公司生产，4?mg/片，批号为04070057;Real Time PCR 试剂盒购自Qiagen公司;RTPCR试剂盒购自宝生物(大连)有限公司;AMPK和PAMPK一抗及相应二抗均购自美国Cell Signaling公司;蛋白测定试剂盒购自美国BioRad公司;βactin一抗购自美国Ambion公司;Glut4多抗购自Santa Cruz公司。

　　1.3 标本采集 体积分数为10%的水合氯醛3?mL/kg腹腔内注射麻醉大鼠，迅速分离腓肠肌置于液氮中保存。

　　1.4 RTPCR方法 50?mg液氮冻存的腓肠肌匀浆，Trizol法提取总RNA，3?μg总RNA按试剂盒说明进行逆转录(Reverse Transcription，RT)反应。分别取2?μL IRS1、PPARγ反转录产物进行PCR反应，条件：95?℃，5?min预变性;94?℃变性30?s，退火30?s(温度见表1)，72?℃延伸30?s，扩增30个循环，72?℃终末延伸5?min。紫外分光光度计测定A260及A280的吸光值，以二者比值(A260/A280)确定所提取RNA的纯度，所有试验样品要求比值在1.8～2.0之间，以保证提取的RNA纯度。引物由上海博亚生物工程公司合成，其序列见表1。表1 引物序列及退火温度

　　注：GAPDH1为Real time PCR用，GAPDH2为RTPCR用 取10?μL PCR扩增产物于浓度为1.5%的琼脂糖进行凝胶电泳，结束后用Alphaimager 2000 凝胶图像分析系统进行照相和条带密度扫描。为消除每次实验中系统误差对结果的可能干扰，每次实验每个样本均同时检测GAPDH mRNA的水平，作为内参照，测定各个样本各基因的相对表达量。

　　1.5 Realtime PCR定量检测基因表达 首先按上述方法进行RNA的提取和逆转录。然后进行聚合酶链反应定量检测基因表达：在25?μL的PCR体系中加入各样品(AMPKα1、AMPKα2、GLUT4)cDNA 50～100?ng, 引物(序列见表1)0.3?μmol/L, 2×Master Mix 12.5?μL。PCR反应条件：95?℃，15?min热启动;94?℃变性15?s，退火30?s(温度见表1)，72?℃延伸30?s，扩增40个循环。

　　数据计算：△CT=CT目的基因-CTgapdh,再将对照组设为1计算其它各组相对值。

　　1.6 Western blot方法 将液氮冻存的腓肠肌剪碎，裂解，4?℃ 12?000?r/min离心10?min，取上清，测定蛋白浓度。变性，每个样品上样50?μg，电泳3?h。转膜，封闭。加入GLUT4、AMPKα或PAMPKα一抗(稀释浓度均为1∶1?000)，4?℃振荡过夜，相应的二抗常温振荡孵育1?h，ECL法显影。同张膜再次与beatactin抗体孵育，显影，分析计算各蛋白条带和内参的比值。Western blot参照文献[12]进行。

　　1.7 统计学处理 上述每项试验至少重复3次。数据用SPSS 11.5软件处理，两样本均数比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠骨骼肌AMPK表达和活性的改变 与N组相比，HF组大鼠的AMPKα2的mRNA水平降低63%(P<0.05)，而AMPKα1的mRNA水平无变化(P>0.05)，HF+ROS组大鼠AMPKα1和AMPKα2的mRNA水平亦无显著变化(P>0.05)，见图1;HF组大鼠PAMPK和总的AMPK(TAMPK)的蛋白表达水平分别下降46.10%(P<0.05)和79.40%(P<0.05)，罗格列酮干预后，PAMPK蛋白水平较HF组增加51.2%(P<0.05)，而TAMPK的表达无明显改变(P>0.05)，见图2。

　　2.2 大鼠骨骼肌GLUT4表达的改变 与N组相比，HF组大鼠GLUT4 mRNA的表达下调75%(P<0.01)，蛋白表达下降62%(P<0.05)，给予罗格列酮后与HF组相比，GLUT4 mRNA的表达增加46%(P<0.01)，见图3，蛋白表达量增加28%(P<0.05)，见图4。

　　2.3 大鼠骨骼肌PPARγ mRNA水平的变化 与N组相比，HF组大鼠PPARγ的表达降低22.6%(P<0.05),使用罗格列酮干预后PPARγ的水平较HF组增加了146%(P<0.05)，见图5。

　　2.4 大鼠骨骼肌IRS1 mRNA表达的变化 与N组相比，HF组IRS1的表达无显著变化(P>0.05)，而罗格列酮可使IRS1的表达较HF组增加34%(P<0.05)，见图6。

　　3 讨 论

　　动物和人类长期进食高脂饮食均可诱导IR[34]。高脂环境诱导的IR伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常。

　　AMPK最主要的生物学效应是通过感受胞浆内AMP/ATP比值的变化，调节脂肪酸的氧化代谢。此外，AMPK还参与了机体胰岛素敏感性的调节。目前认为，AMPK是机体胰岛素敏感性的一种正调节因子， 其影响胰岛素敏感性的机制与其对脂肪酸氧化代谢的调节作用有关。AbuElheiga等[5]发现，乙酰辅酶A羧化酶剔除的小鼠，其胞内脂肪酸氧化代谢和胰岛素敏感性均增强。Dobbins等[6]发现，应用肉毒碱脂酰转移酶1抑制剂干预后，大鼠骨骼肌脂肪酸氧化能力下降，胰岛素刺激后葡萄糖摄取能力也下降，表现出明显的IR。而AMPK激活后可使乙酰辅酶A羧化酶失活，进而降调胞浆内丙二酰辅酶A的含量，解除了其对肉毒碱脂酰转移酶1(脂肪酸β氧化的关键酶)的抑制作用，促进细胞内脂肪酸的β氧化供能。因此认为这是AMPK调节胰岛素敏感性的机制之一[7]。

　　由此我们推测，AMPK作为一种能量感受器，将机体的能量代谢与胰岛素敏感性直接联系起来，在高脂诱导的IR的发生过程中，表达发生了变化。

　　本研究结果亦表明，高脂喂养5个月后，大鼠骨骼肌中PAMPK、TAMPK的蛋白表达水平均有不同程度的下降，说明高脂影响了大鼠骨骼肌AMPK的表达和活性。AMPK的α1和α2亚基在骨骼肌中均有分布，但通常认为α2在AMPK的活性调节中发挥了更大的作用。在小鼠肌肉中，敲除α2亚基可使AMPK 的活性下降至很低的水平，而敲除α1亚基则无明显影响[8]。 为此本研究进一步测定了AMPKα1和α2的mRNA水平，结果表明，AMPKα2的mRNA水平明显下降，而AMPKα1的mRNA表达则无显著变化，提示在本研究模型中α2为主要变化者。

　　PPARγ是配体激活的转录因子，主要与胰岛素敏感性有关。Woo等[9]研究认为，AMPKα活化可通过激活PPARα和PPARγ的复合激活子1增加小鼠骨骼肌细胞的脂肪酸氧化。本实验结果显示，高脂喂养的大鼠骨骼肌中PPARγ的mRNA水平明显下降，而罗格列酮干预后其表达显著增加，表明PPARγ亦可能参与了高脂诱导的胰岛素抵抗，而且很可能是AMPK的下游作用位点之一。

　　AMPK一方面通过调节脂肪酸β氧化影响胰岛素的敏感性，另一方面还可直接调节GLUT4的表达[1013]，被认为是改善胰岛素抵抗的另一可能机制。GLUT4是葡萄糖转运蛋白家族的成员之一, 其易位是胰岛素信号传递通路被激活后的终末环节。宋春宇等[14]在高脂诱导的胰岛素抵抗大鼠模型中发现有骨骼肌细胞膜GLUT4 转位至细胞膜的受阻,膜上GLUT4表达下降。本研究同样发现高脂喂养可使GLUT4的蛋白及mRNA水平降低，推测AMPK至少部分参与了高脂诱导的GLUT4的表达降低，GLUT4 很可能是AMPK介导的高脂诱导的胰岛素抵抗机制中的另一下游因子。

　　IRS1是胰岛素受体的底物之一。IRS1中丝氨酸的磷酸化对胰岛素抵抗的发生至关重要[15]，Jakobsen等[16]发现AMPK可促进小鼠肌管中IRS1 Ser789的磷酸化, Lin等[17]亦证实，AMPK的激活可诱导IRS1 Ser307的磷酸化，从而影响细胞内的胰岛素信号转导，推测IRS1 可能也是AMPK作用的下游靶点。本研究结果显示，高脂喂养的大鼠IRS1的mRNA 水平无明显变化，这与李春蕊等[18]的研究结果不一致，可能是由于喂养时间及实验条件等方面的影响。但罗格列酮干预后，其IRS1的表达显著增加。

　　罗格列酮是噻唑烷二酮类药物的一种,一般认为其改善胰岛素抵抗的作用机制是活化PPARγ[19],增加GLUT4的表达[20]。另有研究认为罗格列酮具有激活AMPK的作用[2122]。在本研究中，给予罗格列酮后，高脂喂养大鼠骨骼肌中PAMPK的表达明显增加，但其总的AMPK的表达并无明显变化。而GLUT4、IRS1、PPARγ的表达水平均相应发生不同程度的增加。这说明是否磷酸化才是AMPK能否发生作用的关键,罗格列酮可以增加AMPK的活性，并通过 增加PAMPK的表达发挥作用。这些结果均进一步证实了罗格列酮对AMPK活性的影响以及AMPK在高脂诱导的脂毒性中发挥的重要作用。

　　综上所述，本研究结果证明AMPKα等参与了高脂环境诱导的胰岛素抵抗的发生，骨骼肌中AMPK、IRS1、GLUT4和PPARγ表达水平降低导致的胰岛素信号转导和能量代谢异常是胰岛素抵抗的原因之一。而罗格列酮在改善AMPKα表达的同时，也相应的增加了PPARγ、IRS1和GLUT4的表达水平，明显改善了胰岛素抵抗。结合前人研究，我们推测AMPKα可能为罗格列酮在体内改善胰岛素抵抗的中枢作用位点之一，PPARγ、IRS1和GLUT4均可能为其作用的下游靶点。罗格列酮可以通过增加PAMPK的表达，进而分别从PPARγ、IRS1和GLUT4等环节产生调节作用，促进脂肪酸的β氧化，改善胰岛素信号转导，发挥其胰岛素增敏效应，缓解脂毒性。

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