NAD延缓背根神经节轴突变性的实验研究

　　【摘要】 目的 探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)对神经轴突变性的保护作用。方法 用长春新碱处理原代培养的背根神经节细胞，建立轴突变性细胞模型，然后加入不同浓度的NAD，观察神经轴突生长状况，MTT检测背根神经节细胞的生长活性，行神经丝蛋白(NF)免疫组化染色观察神经轴突的变化。结果 损伤组加入长春新碱8?h后，轴突远端发生典型的轴突变性，12?h后轴突肿胀，断裂，24?h后见不到完整的轴突结构。保护组加入NAD后可明显延缓轴突变性，在12?h后仍能保持比较完整轴突结构，24?h后远端发生轻微变性。MTT结果显示：NAD保护组可提高细胞存活率(P<0.01)。轴突计数显示：NAD保护组在加入长春新碱后12?h，只有35%左右的轴突发生变性，而损伤组却高达60%的轴突发生了变性(P<0.01)。结论 NAD对轴突变性具有明显的保护作用，可延缓轴突变性。

　　【关键词】 轴突;背根神经节;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;大鼠，Wistar

　　QI Xiaoxia, LI Zhenhua, ZHANG Jing, LIU Wenjing, LU Jing, FANG Peng, Yang Jie， SUN Jinhao

　　(Department of Anatomy, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To explore the effect of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) in delaying axonal degeneration. Methods Dorsal root ganglion(DRG) cells were isolated from neonate rats and cultured in DMEM/F12 medium, and then treated with vincristine to establish an axonal degeneration model. NAD of different concentrations was added in the culture medium to detect its protective effects. Axonal degeneration was identified by immunocytochemical staining and by MTT analysis, and length and number of DRG cells were determined using the software IPP. Results DRG cells treated with vincristine suffered typical axonal degeneration in the distal end of the axon at 8h in vitro. The axon was swollen and disrupted at 12?h. There was no intact axonal structure after a 24?htreatment with vincristine. The end of the axon had normal axonal structure at 12?h in culture, and the axon had light degeneration at 24?h in vitro culture. MTT analysis showed that the experimental groups containing NAD had higher cell survival rates than the injury groups. Axon counting showed that only 35% of axons degenerated in the experimental groups, while only 60% of axons degenerated in the injury groups. Conclusion NAD plays an important role in preventing axonal degeneration.

　　Key words： Axonal; Dorsal root ganglia; Nicotinamide adenine dinucleotide; Rat, Wistar

　　神经轴突变性是神经源性疾病中常见的一种病理变化，常发生于神经损伤、神经中毒、神经退行性变及肌萎缩侧索硬化等多种疾病。轴突变性常出现于神经细胞死亡之前，是神经元死亡的先兆[1]。通过保护或者延缓轴突变性将为神经损伤及神经退行性疾病提供新的治疗策略。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)是多种前体物质的合成物，包括色氨酸、烟酸、尼克酰胺和尼克酰胺肌苷[2],在能量代谢、体内钙平衡、抗氧化/氧化应激、基因表达、免疫调节、细胞老化等生物学过程中发挥重要作用[3]。实验表明NAD与神经轴突变性密切相关[4]。背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)神经元为感觉性神经元，轴突生长比较长，易于观察和检测，因此，本实验在培养的背根神经节中加入长春新碱，建立了轴突变性细胞模型，观察了不同浓度NAD对轴突变性的保护作用，筛选出最佳保护浓度，为进一步的研究提供了实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 出生1～2?d Wistar大鼠5只，体重10～15?g，雌雄不限， 由山东大学实验动物中心提供;DMEM/F12(1∶1)、胎牛血清、多聚赖氨酸、MTT、DMSO(Sigma公司);B27(Gibco公司);NF200 抗体(mouse antiNF200，Boster公司);长春新碱(广东博宏药业有限公司)。

　　1.2 背根神经节细胞培养 无菌条件下取新生大鼠背根神经节，在解剖显微镜下剥离神经节外膜和神经根。种植在预涂有多聚赖氨酸的24孔培养板内,置入5%CO2培养箱孵育5?d，其间3?d更换1次培养液。培养液的成分为DMEM/F12(1∶1), 其中含5%胎牛血清，B27(1∶50) 。

　　1.3 轴突变性细胞模型的建立 取材背根神经节细胞培养5?d后，分别加入0.005、0.01、0.02、0.05?mmol/L?的长春新碱，建立轴突变性细胞模型，筛选出作用最佳的长春新碱浓度。

　　1.4 实验分组 ①正常组：细胞按照正常情况培养。②损伤组：直接加入长春新碱，并于不同时间在倒置相差显微镜下观察轴突变性情况。③保护组：于损伤前12、24?h预孵育，分别设NAD 0.5、1.0、2.0、5.0?mmol/L 4个浓度段，观察各个组段的变性情况。

　　1.5 MTT比色微量分析 取正常组、损伤组及保护组的4种不同浓度，培养5?d后，每孔加MTT溶液15?μL。孵育4?h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150?μL DMSO，振荡10?min，使结晶物充分融解。在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，波长为570?nm，测定每孔OD值。

　　1.6 轴突计数及长度测量 取损伤组及NAD保护组光镜下拍照后，用ImagePro Plus 4软件行图像分析。依据Wagstaff等方法[5]，把从胞体到轴突最远端的垂直距离扫描定为轴突长度[6],计算大约200根以上轴突，取其平均值。从3个不同区域中随机选择50个细胞作为每次观察点，计数轴突数目，t检验作统计分析。

　　1.7 细胞免疫荧光化学染色 取待染细胞的盖玻片，4%多聚甲醛室温固定30?min;PBS洗3次，0.5%TritonX100孵育15?min;PBS洗3次，每次3?min，正常马血清封闭30?min，不洗;加入NF200抗体(1∶200)，4?℃过夜。PBS漂洗3次，每次5?min，加入抗兔荧光二抗(罗丹明标记)，37?℃孵育30?min，PBS冲洗后，甘油-碳酸盐缓冲液封片，观察。

　　1.8 统计学处理 采用SAS8.0软件包，实验数据用

　　2 结 果

　　2.1 轴突变性细胞模型的建立 背根神经节细胞培养5?d后，可见大量长短不一的轴突，有的挺直，有的弯曲，还有的集结成束加入0.05?mmol/L的长春新碱4?h时细胞完全变性、8?h时观察不到细胞(图1A、B)。加入不同浓度长春新碱后，轴突从远端开始肿胀，轴突离断，轴突近侧断端呈球状，神经元凝结成大小不等的分离的小泡[9]。本研究在不同浓度的长春新碱毁损实验中，以0.01?mmol/L浓度组轴突变性最为明显，易于观察(图1)。因此，我们在后续实验中选用0.01?mmol/L 的长春新碱，建立了稳定的轴突变性细胞模型。

　　2.2 神经丝蛋白 (neurofilament，NF )免疫组织化学染色 取损伤组及1.0?mmol/L NAD保护组培养的背根神经节细胞，行NF200神经轴突特异性免疫荧光染色，进一步检测神经轴突的生长及变性情况。结果显示，NAD保护组轴突排列有序，挺直，远段可集结成束(图3A、 B)。损伤组轴突排列稀疏，长度较短(图3C、D)。

　　2.3 轴突计数、长度改变 本研究结果显示，NAD预孵育24?h后，只有35%左右的轴突发生变性，而损伤组却高达60%的轴突发生了变性(P<0.05)。这一结果进一步说明适当浓度的NAD能够延缓轴突变性(图4)。Immunofluorescence staining of NF presented positive axon(×200)

　　3 讨 论

　　轴突变性是神经损伤和神经退行性疾病常见的病理变化，是导致神经元死亡及神经功能障碍的重要原因。轴突变性可活化神经元细胞死亡的上游区，导致神经功能障碍[7]。也有研究表明，抑制和延缓轴突变性，是保护神经元存活、促进神经再生、重建神经功能的有效方法[8]。

　　NAD是多种前体物质的合成物，包括色氨酸、烟酸、尼克酰胺和尼克酰胺肌苷，他们是NAD的下游物质，参与了NAD合成，并能够延缓轴突变性[9]。NAD是公认的细胞代谢中的关键分子，在哺乳动物，它可作为许多脱氢酶辅助物，还充当蛋白酶作用物，如PARP和Sir2蛋白。为了检测NAD在神经轴突变性中的作用，本实验分别应用0.005、0.01、0.02、0.05?mmol/L的长春新碱，建立轴突变性细胞模型，实验结果显示，应用0.01?mmol/L的长春新碱时，轴突4?h时从远端开始肿胀，8h时轴突碎裂，近侧断端呈球状，神经凝结成大小不等的分离的小泡，而选用0.05?mmol/L的长春新碱，则在4?h就完全碎裂;其他浓度都不能很好地建立变性模型，因此，我们筛选出0.01?mmol/L为最佳的浓度，建立了稳定的轴突变性模型。我们在培养的背根神经节中加入0.5、1.0、2.0、5.0?mmol/L 4种不同浓度的NAD，毁损前加入NAD，并对毁损前进行12、24?h预孵育，实验结果证实，保护组中NAD预孵育24?h，1.0?mmol/L NAD, 在12?h后轴突形态仍比较完整，24?h后远端发生轻微变性。而保护组中NAD预孵育12?h，在12?h后始有轻微的轴突变性，24?h轴突形态遭受严重破坏。MTT检测结果显示：加入不同浓度的NAD，OD值均明显高于单纯毁损组，其中1.0?mmol/L NAD保护作用明显。NF染色与轴突计数分析也表明1.0?mmol/L NAD能够很好地延缓轴突变性。综合上述实验，我们筛选出了变性前最佳保护时间及保护浓度，即变性前24?h，1.0?mmol/L NAD最适宜。

　　NAD生物合成途径活化的活性，在不同的阶段，形成保护来对抗轴突变性。但是Araki等[10]发现，如果在DRG细胞的培养中在损伤之前加入NAD，细胞对轴突变性的抵抗作用虽然有所增强，但效果不是太明显，说明对抗轴突变性的作用不只是通过促NAD合成这一条途径。新近的研究显示，在轴突变性延缓的Wlds鼠和Namat1基因转染的背根神经节细胞中，SIRT1和NAD的表达都明显增强[8]，提示SIRT1是其关键下游调控因子[11]。这些实验均标明SIRT1和NAD与轴突变性密切相关。

　　轴突变性的分子机制在很大程度上还是未知的，NAD具体保护轴突变性的机制尚需进一步的研究。

　　【参考文献】

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　　[5] Wagstaff M J, Collaco2Moraes Y, Smith J, et al. Protection of neuronal cells from apop tosis by Hsp27 delivered with a herpes sim2p lex virus2based vector [J]. J Biol Chem, 1999, 274(8):50615069.

　　[6] Suzuki K, Koike T. Mammalian Sir2related protein (SIRT)2mediated modulation of resistance to axonal degeneration in slow Wallerian degeneration mice: A crucial role of tubulin deacetylation[J]. Neuroscience, 2007, 147(3):599612.

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　　[9] Ferri A, Sanes J R, Coleman M P. Inhibiting axon degeneration and synapse loss attenuates apoptosis and disease progression in a mouse model of motoneuron disease[J]. Curr Biol, 2003, 13(8):669673.