脂多糖诱导人角膜基质细胞核因子κB的活化表达及意义

　　【摘要】 目的 研究脂多糖(LPS)诱导人角膜基质细胞核因子κBp65 (NFκBp65)和NFκB抑制因子α(IκBα)的表达及意义。方法 原代培养人眼角膜基质细胞，用免疫细胞化学SABC方法进行细胞鉴定。采用绿脓杆菌LPS刺激角膜基质细胞，分别于刺激前(0?h)，刺激后1、2、4、8?h收集细胞。Western blot检测胞浆内IκBα蛋白及胞核内NFκBp65蛋白的表达。结果 与0?h相比，LPS刺激细胞1?h时，即可检测到胞核内NFκBp65蛋白表达增加，其电泳条带的光密度值随着刺激时间的延长而逐渐变亮，4?h表达最高。LPS刺激细胞后各时点的NFκBp65蛋白表达与0?h组比较，差异有统计学意义(P均<0.01)。LPS刺激角膜基质细胞后，在各时间点均可引起胞浆IκBα表达下降，4?h?时表达最低(P均<0.01)。结论 LPS可引起人眼角膜基质细胞IκBα的降解，促进NFκB的核转位，在角膜炎的过程中可能起一定的抗炎作用。

　　【关键词】 脂多糖;角膜基质;NFκB;NFκB抑制因子α

　　CHEN Guoling1，2，　　CHEN Shuang3，　LIU Yanli1，　WEI Luwan1, LIU Zhiyu1

　　(1. Department of Anatomy, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2. Ophthalmic Center of Shandong University, Department of Ophthalmology, Second Hospital of Shandong University,

　　Jinan 250033, China; 3. People′s Hospital of Shanting District， Zaozhuang 277200, Shandong, China)

　　To investigate expressions and significance of nuclear factorkappaB(NFκB) and inhibitor of NFκB (IκB)αinduced by lipopolysaccharide(LPS) in cultured human corneal fibroblasts. Methods Human corneal fibroblasts were primarily cultured and identified by the SABC method. Immunocytochemical staining with an antibody against Vimentin was performed to identify these cells. Cells were collected before being challenged with LPS and 1,2,4 and 8h after LPS treated, then protein expressions of NFκBp65 and IκBα were assessed by Western Blot analysis. Results Compared with the 0?h group, NFκBp65 level was significantly enhanced in the nucleus of human corneal fibroblasts after LPS challenge of 1 to 8?h(P<0.01), the peak expression of NFκBp65 was observed at 4?h. However， the protein of the IκBα level was significantly decreased after LPS treatment at each point(P<0.01). Conclusion These results suggest that LPS takes part in the degeneration of IκBα and mediates nuclear translocation of NFκB in cultured human corneal fibroblasts in vitro.

　　Key words： Lipopolysaccharide; Corneal stroma; Nuclear factorkappaB; Inhibitor of NFκBα 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌破裂后由细胞壁外膜释出的具有特殊结构的物质。LPS是诱发炎症反应的主要致病成分[1]。核因子κB (nuclear factorkappaB, NFκB)是广泛参与机体免疫、炎性反应、应激反应等生理病理过程的重要核转录因子，调控多种生长因子、粘附分子及细胞因子的表达[23]。本研究以绿脓杆菌LPS刺激人角膜基质细胞作为炎症细胞模型, 观察LPS刺激对角膜基质细胞NFκBp65、NFκB抑制因子α (inhibitor of NF κBα,IκBα)表达的影响，探讨其在角膜损害中的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与材料 液体培养基(MEM)购自美国Hyclone公司;IκBα、NFκBp65和波形纤维蛋白(Vimentin) 一抗分别购自美国Neomarkers公司和Santa cruz公司;绿脓杆菌LPS为美国Sigma公司产品。细胞培养皿、培养瓶、离心管、培养板等培养用品系美国Costar公司产品。

　　1.2 取材和角膜基质细胞培养 无菌条件下取用于角膜移植术的健康供体角膜的剩余部分，采用角膜基质组织块培养法原代培养人眼角膜基质细胞。用含有10%胎牛血清的MEM培养基，于37?℃，5%CO2细胞孵育箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况和细胞形态。原代培养的角膜基质细胞生长至约80%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞进行细胞传代。选取第4代角膜基质细胞用于本研究[4]，实验前换用无血清的MEM基础培养液，培养24?h，使细胞达到同步化。用绿脓杆菌LPS(终浓度10?μg/L)刺激角膜基质细胞，分别于刺激前(0?h)、刺激后1、2、4、8?h弃去细胞培养液，PBS冲洗两遍，离心、收集细胞备用。

　　1.3 角膜基质细胞的免疫细胞化学鉴定 将体外培养的角膜基质细胞进行传代培养(0.25%胰蛋白酶)，将传代细胞传至平铺于六孔板底部的玻片上。细胞培养至80%融合时取出玻片，参照免疫细胞化学的试剂盒说明书进行操作。依次将玻片行PBS漂洗、4%多聚甲醛固定、3%BSA封闭后，分别加入一抗(Vimentin)、二抗、磷酸缓冲液漂洗等，最后DAB显色，显微镜下控制反应时间，蒸馏水冲洗终止反应，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。全自动显微照相机(日本Olympus公司)镜下观察并拍照。

　　1.4 Western blot检测人眼角膜基质细胞NFκBp65和IκBα蛋白的表达 4?℃下进行操作。参照试剂盒说明书分别提取体外培养的角膜基质细胞蛋白，考马斯亮蓝法(Bradford法)进行蛋白定量分析，备用。取等量的蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离后，电转膜方法将电泳产物转至硝酸纤维膜上，依次进行5%牛血清白蛋白封闭、加一抗、二抗，显色、终止反应等步骤。经全自动图象分析系统处理并分析硝酸纤维膜上的蛋白条带的光密度值，记录实验结果并进行统计学处理。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS11.0软件进行统计学处理，实验结果用±s表示，单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 角膜基质细胞的形态学特征及免疫细胞化学鉴定 见图1。倒置显微镜观察到角膜基质组织块接种后第4天，可见有细胞自组织块表层及周边爬出，刚长出的细胞多为梭形，也有的细胞呈三角形或多角形(图1A)。原代培养的角膜基质细胞培养到2周左右，细胞逐渐增多，轮廓趋于清晰，可见到核仁。角膜基质细胞渐渐密集，融合的细胞呈纤维细胞外观，排列呈螺旋状或漩涡状(图1B)。传代培养的角膜基质细胞增殖速度较原代细胞快。免疫细胞化学方法显示体外培养的角膜基质细胞Vimentin蛋白表达为阳性(图1C、D)。角膜基质细胞的形态学特征及免疫细胞化学观察

　　A: 角膜基质组织块接种后第4天，可见细胞自组织块爬出(×200);B：融合的原代细胞排列成“漩涡"状(×100);C:免疫细胞化学阴性对照(×400);D: 角膜基质细胞的免疫细胞化学鉴定：培养细胞的波形纤维蛋白(Vimentin) 表达为阳性 (SABC×400)

　　2.2 LPS刺激对角膜基质细胞NFκBp65核转位的影响 见图2。 Western blot 结果显示：在绿脓杆菌LPS刺激体外培养的角膜基质细胞1?h时，细胞表达NFκBp65蛋白的水平较LPS刺激前(0?h)明显增加，图象扫描光密度值分别为73.608?3±5.130?2和26.723?3±3.344?9，(q=19.898?6，P<0.01)，NFκBp65蛋白电泳条带的亮度及光密度值随刺激时间延长而逐渐升高，至4?h时，条带最亮，光密度值为162.970?0±7.077?2，为LPS刺激前(0?h)的6倍。8?h时，NFκBp65表达(109.703?3±5.546?7)较4?h时下降。角膜基质细胞表达NFκBp65蛋白的水平在LPS刺激后各时点均较0?h组明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 LPS刺激对角膜基质细胞IκBα表达的影响 见图3。用绿脓杆菌LPS刺激体外培养的角膜基质细胞1?h时，细胞表达IκBα蛋白的水平较LPS刺激前(0?h)明显下降，且随刺激时间延长而逐渐下降，刺激角膜基质细胞4?h时，IκBα表达水平达最低(光密度值为19.325?1±2.625?8)，仅为LPS刺激前(0?h)的1/3(q=31.580?7，P<0.01)，条带光密度值的结果显示角膜基质细胞IκBα蛋白表达的下降有时间依赖性, LPS刺激细胞后各时点IκBα蛋白的表达较LPS刺激前(0?h)明显下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。由于IκBα是NFκB的抑制性单位，其表达水平下降代表NFκB的活化,本结果表明，LPS可诱导角膜基质细胞NFκB活化。

　　3 讨 论

　　NFκB是一种多效性转录调控因子，由p65和p50亚单位组成。NFκB的p65亚基与IκB形成三聚体以无活性状态存在于细胞浆内，当细胞受到某些细胞外刺激信号(如多种细胞因子、病毒、LPS等)时， IκBs降解、与NFκB解离。解离后的NFκB移位到细胞核，广泛参与机体免疫、炎性反应，应激反应等生理病理过程[56]。NFκB活化是以NFκB与IκBs解离，由胞质移位到胞核为特征的，故胞核内NFκB和胞浆内IκBs的表达用来评价NFκB的活化。LPS可激活NFκB信号途径，诱导炎症因子的表达，引起细胞损伤和凋亡，导致炎症反应[7]。角膜基质层含有多种细胞因子受体，是病原体侵入后，角膜的免疫和炎症反应发生的主要区域[8]。而角膜基质细胞是炎症反应的主要靶细胞。体外培养的人角膜基质细胞常被用作研究角膜病理生理的靶细胞[9]。为探讨LPS对人眼角膜基质细胞NFκB活化的影响，本研究采用组织块培养法原代培养人眼角膜基质细胞并进行传代培养，倒置显微镜下观察细胞形态并经过细胞鉴定，结果表明，组织块培养法可以成功体外培养角膜基质细胞，细胞形态呈纤维细胞外观，并经过免疫细胞化学鉴定为基质细胞。

　　在角膜炎的发病过程中有许多细胞因子起着重要作用，而NFκB在转录水平调控着这些因子的表达，故适当抑制NFκB可作为治疗炎症性角膜疾病的重要靶位。因此，基质细胞中NFκB在致炎因素LPS刺激后的变化对于整个角膜而言，具有一定代表性，研究角膜基质细胞对探讨角膜炎症的发生发展具有重要意义。为探讨绿脓杆菌LPS对体外培养的人眼角膜基质细胞NFκB活化的影响，本研究采用体外培养角膜基质细胞并用LPS刺激，western blot检测LPS刺激角膜基质细胞后的不同时点的细胞核中NFκBp65和胞浆内IκBα的表达。本研究结果表明：LPS刺激角膜基质细胞1h时，即可检测出角膜基质细胞胞核中NFκBp65表达增多，其随刺激时间延长而逐渐升高，4h表达最高，随后下降。提示：在未受刺激的角膜基质细胞中，NFκB与IκB结合以三聚体化合物形式、处于非活化表达状存在于细胞浆内，当细胞受到细胞外刺激信号LPS时，蛋白激酶被激活,引起IκBs的磷酸化和降解，使IκB与NFκB解离。解离后的NFκB通过核孔移位到细胞核，成为能够与特定序列DNA结合的活性形式，调控多种含有κB位点的基因转录，即NFκB被活化。本研究发现伴随角膜基质细胞胞核内NFκBp65表达增多的同时，胞浆内IκB表达的下降，二者有一定的时间依赖性，这是因为IκB也是NFκB的靶基因[10]，故IκB的基因转录和蛋白质合成也受NFκB的调节，即：LPS刺激导致角膜基质细胞的IκB与NFκB解离、NFκB活化，NFκB活化引起IκB逐渐增多，而IκB的基因启动子中含有多个NFκB结合序列，增多的IκB与NFκB再次结合而使NFκB表达下降，伴随NFκB的活化、IκB渐渐增多，NFκB与IκB结合的数量随之增多，导致NFκB活化下调。

　　NFκB与多种疾病有关，研究表明，多种细胞因子与炎性反应的发生、发展及角膜组织的损伤程度密切相关，而这些因子均有κB位点，其转录调控均有NFκB的参与,这与我们以往的研究结果一致[1112]。因此，寻找NFκB的抑制药物，在基因水平调控细胞因子的表达，对临床治疗各种相关疾病有良好的应用前景。

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