FEZ1基因在食管鳞癌中的表达及意义

　　【摘要】 目的 探讨肿瘤抑制基因FEZ1在食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌临床病理特征之间的关系。方法 采用原位杂交法检测50例食管鳞癌及正常食管组织中FEZ1 mRNA的表达情况，采用Western blot法检测FEZ1蛋白在低分化食管癌细胞株EC1和高分化细胞株EC9706中的表达，分析其与食管鳞癌患者各临床病理指标的关系。结果 FEZ1 mRNA在食管鳞癌组织中的阳性表达率为42.0%，显著低于正常食管组织(86.0%)(P=0.000);随肿瘤分化程度的升高，FEZ1 mRNA的阳性表达率也逐渐增加(P=0.007)，并且其在食管鳞癌组织中的阳性表达率与淋巴结转移密切相关(P=0.013)。Western blot结果显示FEZ1 蛋白在食管癌低分化细胞株中的表达水平低于食管癌高分化细胞株,但差异无统计学意义(P=0.062)。结论 在食管鳞癌组织中存在FEZ1基因的失表达，其缺失与食管鳞癌的分化和转移有关。

　　【关键词】 食管鳞癌 FEZ1 原位杂交 蛋白质印迹

　　Significance of expression of FEZ1 gene in esophagealsquamous cell carcinoma

　　LI Na，WANG Hongxing，ZHANG Jie，et al

　　1.Department of Pathology,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China;

　　2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Zhengzhou University,Henan Key Laboratory of Tumor Pathology,Zhengzhou 450052,China;

　　3.Department of Clinical Immunology,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China

　　Abstract: Objective To investigate expression of tumor suppressor gene FEZ1 and relationship between FEZ1 expression and clinicopathological features of esophageal squamous cell carcinoma.Methods The expression of FEZ1 mRNA in 50 cases of esophageal carcinoma and 50 cases of normal esophageal mucoma were detected by in situ hybridization (ISH).The expression of protein in esophageal carcinoma cell lines,EC1 with low differentiation and EC9706 with high differentiation,was detected by Western blot.Results The positive expression rate of FEZ1 mRNA in esophageal squamous cell carcinoma (42.0%) were significantly lower than in normal esophageal mucoma (86.0%)(P=0.000).The positivity of FEZ1 mRNA in esophageal squamous cell carcinoma was related with differentiation(P=0.007) and lymph node metastasis(P=0.013).The expression of protein in low differentiated cell was lower than that in high differentiated cell,but there was no significant difference between them(P=0.062).Conclusion Missing expression of FEZ1 gene may be relation with differentiation and metastasis in esophageal squamous cell carcinoma.

　　Key words: esophageal squamous cell carcinoma;FEZ1;in situ hybridization;western blot

　　FEZ1/LZTS1基因是1999年Ishii等发现的新的候选抑癌基因，位于人类染色体8p22，编码1个596个氨基酸的蛋白质，相对分子量为67 000，包含1个亮氨酸锌指结构域，与cAMP依赖的转录激活因子5的DNA结合区有32%的同源性[1]。目前研究发现FEZ1蛋白在许多正常组织中表达很普遍，但在50%以上的肿瘤组织中存在异常表达[23]。有关FEZ1基因在食管鳞癌组织中表达情况的研究，国内外鲜见相关报道。本研究采用原位杂交技术检测了食管鳞癌及正常食管黏膜中FEZ1 mRNA的表达情况，采用Western blot技术检测FEZ1蛋白在不同分化程度食管癌细胞株中的表达，探讨其在食管鳞癌发生、发展过程中的作用，为食管癌的早期诊断、基因治疗和判断预后提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本收集及处理

　　收集新乡市中心医院2006年3月至2006年10月食管癌新鲜手术切除标本20例和新乡医学院第一附属医院2006年1月至2006年9月食管癌新鲜手术切除标本30例，经病理组织学证实50例食管癌均为鳞状细胞癌，切缘黏膜均为正常食管黏膜组织。50例食管鳞癌患者术前均未接受化疗、放疗及其他治疗。其中男26例，女24例;年龄38～78岁，平均(61.5±8.5)岁;高分化10 例，中分化29例，低分化11例;浸润深度：浸及浅肌层者(浅层)11例，浸及深肌层或纤维膜者(深层)39例;有淋巴结转移者27例，无淋巴结转移者23例。

　　1.2 主要试剂及细胞株

　　预杂交液、胃蛋白酶、链亲合素耦合碱性磷酸酶(streptavidin alkaline phosphatase，SAAP)、5溴4氯3吲哚磷酸/四氮唑盐(BCIP/NBT)均购自武汉博士德生物技术有限公司。原位杂交探针5'端生物素标记、全硫代修饰由北京奥科生物技术有限公司设计并合成。探针序列如下：GCC TGG CAG TAG CAG CTG GCT TCC T;FEZ1兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。食管癌细胞株EC9706由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，食管癌细胞株EC1由香港大学曹世华教授惠赠。

　　1.3 原位杂交染色

　　标本经新鲜配制二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，用新鲜配制的体积分数0.5% H2O2室温处理30 min，以灭活内源性过氧化物酶;质量分数3%柠檬酸新鲜配制蛋白酶，37 ℃，10 min，消化标本DNA结合蛋白;每张玻片滴加20 μL不含探针的预杂交液，42 ℃预杂交4 h;加含探针(1 ng·L-1)的杂交液，42 ℃湿盒内杂交12 h;0.1×标准柠檬酸盐42 ℃洗涤，加SAAP，37 ℃，10 min;漂洗后加BCIP/NBT，避光显色2～4 h，以不含探针的标本作阴性对照。

　　1.4 结果判定

　　FEZ1 mRNA阳性信号呈棕紫蓝色颗粒样物质，位于细胞浆内。参照文献[4]，在高倍视野下(400×)随机选取5个视野(每个视野观察不少于200个细胞)，按阳性细胞所占的百分比及着色强度进行结果判定：(1)按着色强度评分：0分为无着色;1分为淡蓝色;2分为深蓝色;3分为蓝紫色。(2)按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：0分为阴性，1分为阳性细胞数≤10%，2分为阳性细胞数11%～50%，3分为阳性细胞数51%～75%，4分为阳性细胞数>75%。取(1)、(2) 2项评分的乘积作为总积分，0～3分为阴性(-)，3分以上为阳性(+)。

　　1.5 Western blot检测

　　按照细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒说明书(凯基生物公司)冰上操作所有过程，分别提取细胞质、细胞核蛋白，Bradford 法检测蛋白质的含量，蛋白上清经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrohoresis,SDSPAGE)电泳(体积分数5%浓缩胶，体积分数15%分离胶)后转移至硝酸纤维素膜，用含质量分数1%脱脂奶粉的TBST (TrisBuffered Saline Tween20)封闭30 min，一抗于4℃孵育过夜，TBST洗涤3次×10 min;辣根过氧化物酶标记的二抗于室温孵育2 h，TBST洗涤3次×10 min，膜与化学发光底物孵育5 min，经X线片曝光、显影、定影。显色结果用软件TotalLab2.0进行灰度分析，并计算蛋白的相对表达水平。

　　1.6 统计学处理

　　实验结果应用SPSS 10.0统计分析软件进行分析，计数资料采用χ2检验，检验水准α=0.05，各组间相对表达水平的比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 FEZ1 mRNA在食管鳞癌组织及正常黏膜组织中的表达

　　FEZ1 mRNA在食管鳞癌组织中定位于肿瘤细胞胞质，在正常食管黏膜组织中定位于上皮细胞胞质，均呈蓝紫色颗粒，对照组标本中无阳性信号显示。50例食管鳞癌组织中有21例(42.0%)FEZ1 mRNA表达阳性，29例(58.0%)FEZ1 mRNA表达缺失;50例正常食管黏膜组织中有43例(86.0%)检测到FEZ1 mRNA的阳性表达，显著高于食管鳞癌组织(P=0.000)。

　　2.2 FEZ1 mRNA的表达与食管鳞癌临床病理特征的关系

　　随癌细胞分化程度的增加，FEZ1 mRNA的阳性表达率增高，高分化组FEZ1mRNA阳性表达率为70.0%，明显高于中、低分化组(42.5%，P=0.007)。在有淋巴结转移组FEZ1 mRNA的阳性表达率为25.9%，显著低于无淋巴结转移组(60.9%，P=0.013)，FEZ1 mRNA的表达与食管鳞癌患者的浸润深度无关(P=0.340)，见表1。表1 食管鳞癌组织中FEZ1 基因的表达与临床病理学特征的关系(略)

　　2.3 FEZ1蛋白在食管癌细胞株中的表达

　　FEZ1蛋白在2种不同分化程度的食管癌细胞株中均有表达。FEZ1蛋白在低分化细胞株EC1中的表达水平为0.805±0.107，低于高分化细胞株EC9706中的表达(0.874±0.092)，但差异无统计学意义(P=0.062)。

　　3 讨论

　　FEZ1基因定位于8p22上，编码1个相对分子量为67 000的亮氨酸锌指蛋白，其可以与微管、延长因子 (elongation factor,EF)1γ、p34cdc2CyclinB激酶复合体起作用，调节细胞的增殖和有丝分裂，在肿瘤的发生及浸润、转移等过程中发挥重要作用。近年来研究发现FEZ1在许多正常组织中普遍表达，而在许多人类肿瘤包括膀胱移行细胞癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等组织中都存在异常表达[3，5]。有关FEZ1基因的突变已经在包括乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌在内的几种实体肿瘤中被报道[1，6]，并认为FEZ1基因具有调节细胞增殖和有丝分裂，抑制细胞增殖和肿瘤形成的作用。本实验结果显示，在50例食管鳞癌标本中仅有21例存在FEZ1 mRNA的阳性表达，其阳性表达率显著低于正常食管黏膜组织，并且随癌细胞分化程度的增加，FEZ1 mRNA的阳性表达率显著增高，在有淋巴结转移组FEZ1 mRNA的阳性表达率显著低于无淋巴结转移组。另外KISS1蛋白在不同分化能力细胞株中的表达虽无显著性差异，但其在高分化细胞株EC9706中的表达高于低分化细胞株EC1，这说明FEZ1基因可能与食管癌的发生、分化及转移能力有关，因此FEZ1可望成为食管癌早期诊断和预后评估的重要指标。

　　本实验结果还与Vecchione等[7]在对肾集合管癌的研究中所得结果相一致，Vecchione等研究发现在11例肾集合管癌中有7例(64%)存在FEZ1蛋白表达减少或缺失，并且FEZ1的表达减少或缺失与淋巴结转移密切相关。目前有学者认为，FEZ1基因在作为1个候选抑癌基因而发挥作用，但其抑癌作用机制还不十分清楚[89]。

　　Vecchione等[10]在缺失内源性的FEZ1的膀胱癌细胞株中通过腺病毒将FEZ1转染SW780细胞，观察了FEZ1对膀胱癌细胞的细胞动力学及致瘤性的影响，结果发现：转染后的48 h有该基因的完全表达，并且出现生长抑制、细胞周期停留在G/S期，有一部分还出现了细胞的凋亡。在对FEZ1和P34之间关系的研究中发现FEZ1可能通过某种机制来控制p34CyclinB1复合物而使细胞维持在G/M期，若FEZ1的表达缺失或破坏，使细胞可以逃避有丝分裂的正常周期而致肿瘤无限增殖。动物的致瘤性实验表明FEZ1的转染不仅仅减少了肿瘤的大小，而且还抑制了肿瘤的增长。在食管癌中FEZ1表达减少或缺失，可能也是通过其逃避了正常细胞周期，使细胞无限制增殖，而参与了食管癌的发生发展。

　　目前为止，FEZ1基因表达减少或缺失的原因还不清楚，Ishii等[1]在对前列腺癌、食管癌和乳腺癌等多种上皮肿瘤进行分析时发现2个食管癌以及1个前列腺癌细胞株中该基因存在点突变，同时他们还发现在乳腺癌细胞株中有单一重排和等位基因的缺失，因此该基因的失活可能包括基因的缺失或突变，但其失活的确切机制还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Ishii H,Baffa R,Numta SI,et al.The FEZ1 gene at chromosome 8p22 encodes aleucinezipper protein,and its expression is altered in multiple human tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(7):39283933.

　　[2]Ono K,Uzawa K,Nakatsuru M,et al.Downregulation of FEZ1/LZTS1 genewith frequent loss of heterozygosity in oral squamous cell carcinomas[J].Int J Oncol,2003,23(2):297302.

　　[3]Ishii H,Vecchione A,Murakumo Y,et al.FEZ1/LZTS1 gene at 8p22 suppresses cancer cell growth and regulates mitosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):1037410379.

　　[4]尹磊,张功员,刘 键,等.食管鳞状细胞癌中EGF蛋白和mRNA的表达[J].郑州大学学报：医学版,2007,42(6):10991101.

　　[5]Nnoaka D,Fabbri A,Roz L,et al.Reduced FEZ1/LZTS1 Expression and outcome prediction in lung cancer[J].Cancer Res,2005,65(4):12071212.

　　[6]Vecchione A,Ishii H,Shiao YH,et al.Fezl/lzts1 alterations in gastric carcinoma[J].Clin Cancer Res,2001,7(6):15461552.

　　[7]Vecchione A,Galetti TP,Gardiman M,et al.Collecting duct carcinoma of the kidney:an immunohistochemical study of 11 cases[J].Bmc Urol，2004,9(4):11.

　　[8]Vecchione A,Croce CM,Baldassarre G,et al.FEZ1/Lzts1 a new mitotic regulator implicated in cancer development [J].Cell Div,2007,24(2):24.

　　[9]Hosseini HA,Ahani A,Galehdari H,et al.Frequent loss of heterozygosity at 8p22 chromosomal region in diffuse type of gastric cancer[J].World J Gastroenterol,2007,13(24):33543358.