2种制备Taq DNA聚合酶方法的比较

　　【摘要】 目的 比较2种制备纯化Taq DNA聚合酶的方法，为PCR提供实验用酶。方法 Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli菌株，IPTG诱导12 h后收集菌体，分别用硫酸铵沉淀法和冻融法进行纯化，SDSPAGE电泳和PCR扩增分析比较其纯度和活性。结果 硫酸铵沉淀法制备的Taq DNA聚合酶活性能可有效扩增DNA 片段;冻融法制备的Taq DNA聚合酶活性较低。结论 硫酸铵沉淀法制备的Taq DNA聚合酶优于冻融法，能够达到分子生物学实验中基因扩增的要求。

　　【关键词】 Taq DNA聚合酶 表达 纯化

　　Comparasion two methods of preparing Taq DNA polymerase

　　QIN Chuan，YANG Xianjun，YANG Rui，et al

　　Laboratory of Molecular Biology，Xinxiang Medical College，Xinxiang 453003,China

　　Abstract: Objective To compare two methods of preparing purified Taq DNA polymerase in order to provide experimental enzyme for polymerase chain reaction(PCR).Methods Using Taq DNA polymerase expression plasmid to transfer E.coli strain,the cells were collected after inducing with Isopropyl βD1Thiogalactopyranoside for 12 hours.The enzyme was purified by ammonium sulfate precipitation and freezethaw method,respectively,and then the activity and purity were analysed by PCR and SDSPAGE.Results The activity of Taq DNA polymerase that prepared by ammonium sulfate precipitation was higher than that prepared by freezethaw method.Conclusion The Taq DNA polymerase purified by ammonium sulfate precipitation is better than the freezethaw method,which can meet the requirement of molecular biology experiment of gene amplification.

　　Key words: Taq DNA polymerase;expression;purification

　　1958年科学家分离出DNA聚合酶后，就曾设想利用DNA聚合酶扩增产生大量DNA。1983年Mullis发明了聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)[1]。但一般DNA聚合酶不耐高温，每一轮聚合反应完成后，都需加入新的聚合酶，这种操作既浪费时间又容易出错。后来Saiki等[2]科学家从温泉的耐热细菌Thermus aquaticus中纯化得到了Taq DNA聚合酶，后来出现了基因工程重组聚合酶[3]。PCR技术发展迅速并得以广泛应用，作为PCR技术关键试剂的DNA 聚合酶在分子生物学实验中也越来越重要，使用的数量也越来越多，由于Thermus aquaticus培养困难，并且其Taq DNA聚合酶的产量也不高，目前市售的Taq DNA聚合酶大都是基因重组产品。作者在综合考虑Taq DNA聚合酶生物学特性和PCR反应体系基础上，开发了快速简便的Taq DNA聚合酶制备方法，以满足实验需要。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及仪器设备

　　含Taq 酶基因的载体pTAQ 由新乡医学院生物化学与分子生物学研究室保存，实验所需的蛋白胨(Triptona)、酵母浸提物(Yeast Extraca) 、乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、异丙基βD硫代半乳糖苷(Isopropyl βD1Thiogalactopyranoside,IPTG)、葡萄糖(Dextrose)、苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluorid,PMSF)、丙三醇(Glycerol)、二硫苏糖醇(DLDithiothreitol，DTT)、Nonidet P40、硫酸铵、溶菌酶等试剂购自上海生工公司。实验所用TGL16G型离心机为上海安亭科学仪器厂产，普通PCR仪美国产MJRESEACHPTC100，凝胶分析系统为Syngene digital imaging station。

　　1.2 方法

　　1.2.1 外源基因在宿主菌中的表达

　　挑取单菌落接种到含60～80 μg·mL-1氨苄青霉素的LB(Lauria Bertaini)培养基中，37℃振荡培养过夜;然后以 120的比例转接到同样的培养基中，37 ℃继续培养到OD600值约为0.8～1.0;加入IPTG至终浓度为125 mg·L-1，诱导12 h，备用。

　　1.2.2 硫酸铵沉淀法

　　参考王天云等[4]的方法。将备用的菌液用离心机3 500 r·min-1离心10 min收集菌体，每1 000 mL菌液离心后加入100 mL洗脱缓冲液(50 mmol·L-1 TrisHCl pH 7.9;50 mmol·L-1 dextrose;1 mmol·L-1 EDTA)重悬;3 500 r·min-1离心3 min重新收集菌体，室温放置15 min，加入50 mL预裂解缓冲液(洗脱缓冲液加 4 g·L-1溶菌酶)，室温放置15 min，加入50 mL裂解缓冲液(10 mmol·L-1 TrisHCl pH=7.9;50 mmol·L-1 KCl;1 mmol·L-1 EDTA;1 mmol·L-1 PMSF;体积分数0.5%Tween20;体积分数0.5% Nonidet P 40)75 ℃孵育1 h，然后将裂解混合液转移到离心管，4℃ 15 000 r·min-1离心15 min，转移上清液至新的离心管中，加入30 g硫酸铵，室温迅速混匀。15 000 r·min-1离心15 min，将蛋白沉淀物重新悬浮至20 mL洗脱缓冲液中，在储存缓冲液(50 mmol·L-1TrisHCl pH 7.9;50 mmol·L-1 KCl;0.1 mmol·L-1 EDTA;1 mmol·L-1 DTT;0.5 mmol·L-1 PMSF;体积分数50%Glycerol中透析至少12 h。透析后，用储存缓冲液11稀释，储存于-80℃。

　　1.2.3 冻融法

　　将备用的菌液用离心机3 500 r·min-1离心10 min收集菌体，每100 mL菌液离心后加入4 mL洗脱缓冲液(50 mmol·L-1 TrisHCl pH 7.9;50 mmol·L-1 dextrose;1 mmol·L-1 EDTA) 悬浮，-70 ℃、75 ℃交替冻融，反复2次;12 000 r·min-1离心20 min，取上清;上清液中加入等体积缓冲液(10 mmol·L-1 TrisHCl pH=7.9;100 mmol·L-1 NaCl;1 mmol·L-1 EDTA;1 mmol·L-1 DDT;体积分数0.5%Tween20;体积分数0.5% Nonidet P40)，75 ℃水浴30 min;12 000 r·min-1离心20 min，取上清液，加入等体积甘油，-20℃保存备用。

　　1.2.4 Taq DNA聚合酶纯度检测

　　十二脘基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrohoresis，SDSPAGE)检测所纯化的 Taq DNA 聚合酶的纯度，将用硫酸铵沉淀法和冻融法纯化制备的Taq DNA聚合酶，以商品酶为对照，各取10 μL加入等量的2×上样缓冲液，100 ℃加热5 min，取上清作SDSPAGE分析，同时将低分子量蛋白标准品作平行处理,具体操作参照文献[5]。

　　1.2.5 PCR反应检测Taq DNA聚合酶活性

　　PCR扩增反应检测所纯化的Taq DNA聚合酶活性,以商品酶为对照，各管所用的模板量相等。PCR反应体系：10×PCR缓冲液2 μL，d NTP 2 μL(dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各1.25 μmol·L-1)，模板 DNA 0.5 μL，引物各0.5 μmol·L-1，自制 Taq DNA聚合酶与对照商品酶均使用1 U聚合酶。PCR扩增DNA片段。PCR反应后取5μL产物于10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测。

　　2 结果

　　2.1 Taq DNA聚合酶纯度

　　从SDSPAGE电泳，检测酶蛋白的结果表明，制备的Taq DNA聚合酶，与商品酶的分子量相符，但纯度相比相对较低。见图1。

　　2.2 Taq DNA聚合酶活性

　　PCR扩增结果表明，采用硫酸铵沉淀法制备Taq DNA聚合酶与市售商品酶有相似的活性，都可有效扩增目的DNA片段，说明与市售产品有相似的比活性;而采用冻融法制备Taq DNA聚合酶与市售商品酶相比活性很差。见图2。

　　3 讨论

　　基因工程Taq DNA聚合酶表达载体的构建便利了该酶的纯化。尽管如此，从细菌培养物中纯化的方法仍很繁琐，需要进行选择性沉淀和离子交换色谱分离[67]。但是，多步骤、长时间的分离纯化不但提高酶制品的成本，而且不利于酶的活性。作者利用培养载有Taq DNA聚合酶的工程菌，在优化其表达条件的基础上，使用硫酸铵沉淀法对其进行分离纯化，采用溶菌酶、NP40裂解细菌，硫酸铵沉淀，透析，热变性沉淀杂蛋白，既克服了过柱纯化时间过长，酶蛋白容易失活的不足，而且还简化了纯化程序，提高了纯化效率，降低了制备成本。虽然纯度与市售商品酶相比仍较低，但其敏感性、特异性、活性均与市售商品酶有相似。

　　作者根据Taq DNA聚合酶热稳定性、耐热性强的特点，用冻融法进行分离纯化，在-70 ℃温度冷冻续以75 ℃融解后，细菌胞膜就会破裂而释放菌体蛋白。除了Taq DNA聚合酶，其他蛋白在75 ℃水浴条件下会变性与DNA大分子缠绕，再经离心可直接去除杂蛋白达到纯化酶的目的。虽然在纯化中没有使用溶菌酶和剧毒物质PMSF，纯化工艺更加简化，但从结果来看，不能充分纯化蛋白，活性也很差，PCR扩增效果十分不理想。

　　使用硫酸铵沉淀法制备TaqDNA聚合酶工艺相对比较简单，成本低，对Taq DNA聚合酶用量大，科研经费紧张的实验室不失为一种好方法。而产品又能在相同的条件下与商品酶在扩增特异DNA片段时的效果是一样的，说明该酶与商品酶性能相同，可用于科研及检测工作，满足实验室的需要，也利于PCR技术更广泛的推广应用，为分子生物学创新实验的开设和实验成本的降低开辟了新的途径。

　　【参考文献】

　　[1]Mullls K,Faioona S,Seharl R,et al.Specific enzymatic amplification of DNA in vitro;The polymerase chain reaction[J].Cold Spring Harbor Symp Quant Biol,1986,51(1):263273.

　　[2]Saiki RK,Scharf S,Faloona F,et al.Enzymatic amplification of betaglobin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia[J].Science,1988,230(4732):13501354.

　　[3]Chien A,Edgar DB,Trela JM.Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus[J].J Bacteriol,1976,127(3):15501557.

　　[4]王天云，秦川，杨瑞，等.基因重组Taq DNA 聚合酶的制备[J].新乡医学院学报，2007，24(6)：551553.

　　[5]何忠效，张树政.电泳[M].北京：科学出版社，1999：127138.

　　[6]何钢，王义强，李 樊，等.大肠杆菌表达重组Taq DNA聚合酶的分离和纯化[J].中南林学院学报,2006,26(5):5054.