声音包络波瞬时声强对小鼠下丘神经元第一发放延时的影响

　　【摘要】 　　目的 采用不同上升时间、幅度和3种不同上升函数的纯音包络波对小鼠下丘神经元给予刺激，探讨神经元第一动作电位发放反应的声刺激参数。方法 在4～6周BALB/c小鼠下丘神经元上，采用在体细胞外记录方法，同时改变声刺激的3个实验控制参数：上升函数、上升时间(分别设为2 ms、5 ms、10 ms、20 ms、50 ms、100 ms)和稳态声压(阈值到90 dB)，并记录对应于特定上升函数、上升时间和稳态声压时的第一动作电位发放延时。然后以特定的数理模型对单单位神经元数据进行分析处理，以确定声刺激的特定参数和神经元对该参数的反应规律。结果 共记录到54个神经元反应。发现神经元第一发放延时与声音刺激的包络波瞬时声强存在着良好的单指数衰减关系。结论 声音包络波的瞬时声强决定了小鼠下丘神经元第一发放延时。

　　【关键词】 短纯音包络波;神经元;下丘;小鼠

　　Influence of instantaneous pressure of sound envelope on the first spike latency of neurons in mouse inferior colliculus

　　YANG Weiguo,WANG Xiao,XIAO Zhongju

　　(Department of Physiology,College of Basic Medicine,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China)

　　Abstract: Objective To explore the sound stimulus parameter of the first spike latency of mouse auditory neurons,by means of modified envelope sound in terms of rise time,sound pressure and rise functions.Methods Extracellular recording technique was employed on central nuclei of inferior colliculus of 4 to 6 weeks BALB/c mouse.The three experimentally controlled parameters of sound stimulus were changed simultaneously,rise time set as 2,5,10,20,50,100 ms separately,sound pressure upmost to 90 dB.Then the first spike latency of auditory neurons were recorded through our softwares(BrainWare of TDT).The singleunit data was processed by our unique mathematical method.Results A total of 54 responses from neurons were gotten.And there was an obvious relationship of single exponential decay between first spike latency of neurons and instantaneous peak pressure of onset of sound envelope.Conclusion First spike latency is determined by instantaneous sound peak pressure in the mouse inferior colliculus neurons.

　　Key words: envelope of tone burst;neuron;inferior colliculus;mouse

　　当用频率范围很窄的声音刺激如短纯音来研究听觉神经元的反应特性时，一方面要考虑所给声音刺激的特性，如刺激声音的起始部分，也就是声音幅度达到稳定时所需要的时间长度,即上升时间(rise time,RT);另一方面，还要考虑探测神经元反应时采用何种指标。目前在研究听觉系统时，发现采用第一发放延时(first spike latency,FSL)做为指标时，结果更为准确可靠[13]，无论这些记录到的神经元来源于何种动物，在听觉通路的哪个位置，这种函数关系可通过Piéron经验公式清楚地描述出来[4]，在听觉系统用该公式拟合出来的函数关系比其他几种感觉系统都要好。有研究假设神经元的FSL可对时间包络波起始部分的一些动态参数反应[5]，还有一些研究发现具有相似波形的纯音产生相似的FSL，即神经元的FSL与上升函数相关[6]。但究竟是刺激起始部分的哪个物理量参与引发了FSL，目前还不清楚。本实验中采用可比较的上升函数PP=SP×(t/RT)n来修饰短纯音，并将n赋值为1、2、3来表示3种具有代表性的上升函数(rise function,RF)，相应地定义为线性RF、平方RF和立方RF，以此来探索声音包络波起始部分的瞬时声强是否是导致FSL发放的关键因素。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　4～6周龄BALB/c小鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，体质量9.5～22.5 g，雌雄不限。实验前所有动物鼓膜和中耳均经过耳镜检查无异常。

　　1.2 手术步骤

　　测体质量后，给小鼠腹腔注射阿托品(0.25 mg·mL-1，1.2 mL·kg-1)以减少气管黏液分泌，然后腹腔注射戊巴比妥钠(15 mg·mL-1，70 mL·kg-1)进行麻醉。首先，去除小鼠头顶部皮肤，将1.5 cm长的带小横杆的钉子垂直粘在头骨上，然后在手术显微镜下进行手术：在一侧下丘上方用钻头钻一约2 mm×2 mm大小的洞，完全暴露下丘。之后将其移至聚乙烯泡沫制成的固定装置中，并移入屏蔽室中。小鼠头部距喇叭正前方30 cm。记录过程中如发现动物有异动或搔爬反射即补麻醉剂。记录过程中动物状态通过数码摄像头监视，并可通过计算机屏幕进行观察。

　　1.3 声音刺激

　　实验中采用短纯音作为声音刺激来获取数据，在电极推进过程中给予50 ms的噪音刺激(50 ms不包括上升时间，上升和下降时间各为5 ms)来探测动物神经元的反应，探测到后再换为相应特征频率的短纯音刺激确定其特征频率和最小阈值(minium threshold,MT)。给声频率为1 Hz。之后短纯音频率设为神经元的特征频率，上升函数采用具有可比性的线性、平方和立方函数，下降函数采用线性函数变化方式(FTfall time)。所有声音时长都为150 ms(包括上升和下降时间，二者函数不对称)，下降时间为5 ms，3个函数中上升时间皆为2 ms、5 ms、10 ms、20 ms、50 ms、100 ms，同时幅度在90 dB标准声压级(sound pressure level,SPL)至最小阈值下10 dB间以5～20 dB或1～3 dB(接近MT时)幅度进行变化。信号经自由场传递至动物。正弦声波以零相位开始给予刺激。每个声音刺激都重复10次。实验前，喇叭用1/8和1/4英寸麦克风及声强校正仪(Brüel and Kjaer 4138,4135,Naerum,Denmark)进行校正。短纯音的幅度用声压级(dB SPL)和稳定压力值(Pa)表示。

　　1.4 数据收集

　　神经元反应一般放大2 000至10 000倍，采用数字放大器(RA16)进行滤波(0.3～3 kHz)，通过BrainWare软件进行记录和显示，同时通过音频监听器(MS2)来进行监听。对信噪比大于41的反应的动作电位进行进一步分析。声音刺激下诱发的动作电位波形、数目和时间都被收集并存储在数据库中。

　　1.5 数据分析

　　在Piéron经验公式[4]和Heil的方程[7]基础上，假设FSL与上述参数呈下面方程(1)所示的函数关系。其中为计算方便将幂函数转为指数函数，即当FSLMFSL>0时(MFSL表示理论上的最小传递延时)，如下所示将方程(1)简化为方程(2)：

　　PSL-MFSL=βe-αχ=β10-(α/ln10)χ(1)

　　lg(FSL-MFSL)=-AlgP+B(2)

　　实验结果在Excel中分析FSL-MFSL与瞬时声压变化之间的关系，并据此做图，做图软件采用OriginPro7.5和Canvas 9.0。为了探寻第一发放延时和上述参数与神经元反应特性之间的关系，利用方程(2)，用OriginPro 7.5软件拟合了所有数据中每个神经元的FSLMFSL与声音瞬时强度之间的函数曲线。

　　2 结果

　　实验共记录到54个单单位神经元，垂直插入小鼠下丘的深度在220～1 530 μm之间。所有神经元对短纯音反应的特征频率范围在5～40 kHz之间，MT在6～58 dB SPL之间。54个神经元中有46个没有显示自发放电，其余神经元自发放电频率小于每秒2次。起始或类起始反应神经元观察到的最多，偶尔观察到持续性反应(图1)。3种不同上升函数下所得的数据基本在一条曲线上，说明不同上升函数的短纯音中只要其包络波起始部分的瞬时声强相同，即可产生相同或近似的延时，且FSL与瞬时声强的函数关系与上升函数无关。

　　3 讨论

　　本研究中，作者将纯音包络波的上升函数用PP=SP×(t/RT)n(n = 1,2,3) 指数函数进行修饰，研究了神经元第一动作电位发放延时与瞬时声强间的关系，结果显示上升函数间的差异可通过瞬时声强同一化。

　　以往关于第一发放延时与声音的稳态声压、上升时间和上升函数的相关性方面的实验曾有较多文献报道，如SP部分[8]、RT部分[910]、 RF部分[3]。结果表明它们之间有相关性，但这并不说明下丘神经元FSL反应的是上述单独的参数。而这些实验中，一般声音刺激实验参数RF和RT是固定的，通过改变SP来改变声音的起始特征，这样得到的关于FSL和SP(幅度)函数的研究显得没有说服力，研究RT时也是如此。而本实验采用线性、平方、立方这3种具有一定规律和可比性的上升函数将SP、RT和RF以及时间t做为一个整体参数来研究神经元反应特性(FSL)和声音刺激特定参数之间的关系。因为自然声不像实验中所给的声音是可以随意修饰、量化、选择性改变的，中枢听觉神经元不可能只反应某一种声音刺激参数如SP、RT或RF，而很可能是反应这些参数(包括时间t)的一个整合效应，FSL与SP、RT或RF的反应关系只是说明这些参数做为某一单独参数可影响神经元的FSL。

　　Heil研究组[11]认为FSL是由刺激最初始的构成成分决定的而非SP，并且FSL与线性RF时瞬时声强变化的速度(dP/dt)或余弦平方时瞬时声强变化的加速度(d2P/dt2max)具有函数关系。作者认为如果声刺激起始部分的某一参数是引发FSL产生的主要参数，则神经元的FSL应当与其呈固定的函数关系，然而，不同上升函数下相同的瞬时声强变化速度对应的FSL有很大不同，瞬时声强变化的加速度也是如此。这就提示神经元FSL与瞬时声强变化的速度或加速度函数随不同RF而发生变化，即决定FSL的主要刺激参数并非瞬时声强变化的速度或加速度。当FSL做为瞬时声强的函数时，不同RF下的差异即可消除，其FSL非常一致(图示)，说明无论包络波起始部分形状如何，只要其瞬时声强相同，所诱发的神经元的反应(FSL)就应当相同或基本一致。

　　本实验结果说明声刺激引起第一动作电位发放的有效作用时间(FSLMFSL)与瞬时声强变量有良好的契合关系，其机制可能是瞬时声强诱发产生神经元发放数，而后者是发放数率随时间的积分，当积分达到引发神经元反应的固定阈值时，神经元第一发放延时随即产生。这些假说还需要很多在突触或(和)单细胞水平的进一步实验支持，以提供更直接的实验证据。

　　【参考文献】

　　[1]Heil P.Firstspike latency of auditory neurons revisited[J].Curr Opin Neurobiol,2004,14(4):461 467.

　　[2]VanRullen R,Guyonneau R,Thorpe SJ.Spike times make sense[J].Trends Neurosci,2005,28(1):1 4.

　　[3]Tan X,Wang X,Yang W,et al.First spike latency and spike count as functions of tone amplitude and frequency in the inferior colliculus of mice[J].Hear Res,2008,235(12):90104.

　　[4]Piéron H.Nouvelles recherches sur l′analyse du temps de latence senorialle et sur la loi quirelie de temp a l′intensite d′excitation[J].L′Annee Psychologique,1920,22:58142.

　　[5]Heil P,Irvine DR.On determinants of firstspike latency in auditory cortex[J].Neuroreport,1996,7(18):30733076.

　　[6]Fishbach A,Nelken I,Yeshurun Y.Auditory edge detection:a neural model for physiological and psychoacoustical responses to amplitude transients[J].J Neurophysiol,2001,85(6):23032323.

　　[7]Biermann S,Heil P.Parallels between timing of onset responses of single neurons in cat and of evoked magnetic fields in human auditory cortex[J].J Neurophysiol,2000,84(5):24262439.

　　[8]Sanes,DH,Rubel EW.The ontogeny of inhibition and excitation in the gerbil lateral superior olive[J].J Neurosci,1988,8(2):682700.

　　[9]Hall JC,Feng AS.Temporal processing in the dorsal medullary nucleus of the Northern leopard frog(Rana pipiens pipiens)[J].J Neurophysiol,1991,66(3):955973.

　　[10]Heil P,Irvine DR.Firstspike timing of auditorynerve fibers and comparison with auditory cortex[J].J Neurophysiol,1997,78(5):24382454.

　　[11]Heil P.Coding of temporal onset envelope in the auditory system[J].Speech Communication,2003,41(1):123134.