细胞调控基因hCHK2多态性与食管癌易感性的研究

　　【关键词】 细胞调控基因 hCHK2多态性 食管癌易感性

　　susceptibility of esophageal cancer ZHANG Huixia, CHEN Yan, YIN Dong, et al

　　(School of Public Health, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)Abstract: Objective: To determine the association between hCHK2 polymorphism and the susceptibility of esophageal cancer in Han nationality. Methods: A casecontrol study was conducted. The polymorphism between hCHK2 gene at rs2278022、rs2602431 and rs2970077 position was analyzed by polymerase chain reactionligase detection reaction (PCRLDR) methods in 107 esophageal cancer cases and 204 noncancer controls. The frequencies of genotype and allele and the association between the genetic polymorphisms and cancer risk were analyzed. Results: No significant difference was observed in the frequency of hCHK2 gene at rs2278022、rs2602431 and rs2970077 position genotypes between cases and controls (P>0.05). Conclusion: The polymorphism of hCHK2 gene at rs2278022、rs2602431 and rs2970077 position is unlikely to be associated with the susceptibility of esophageal cancer.

　　Key words: hCHK2; esophageal cancer; susceptibility; genetic polymorphism随着对细胞周期及其调控的深入认识，学者们提出了“癌症可能是一类细胞周期异常性疾病”的观点[1]。绝大多数肿瘤细胞都存在若干细胞周期调控机制的改变，周期调控机制的异常可导致细胞的持续性增殖，是肿瘤发生的生物学基础。CHK2是近来新发现的一个细胞周期调控蛋白。在发生DNA损伤或复制阻滞后，细胞通过不同途径激活CHK2，进而作用于下游不同的靶蛋白，最终激活G1、S和(或)G2/M期检测点机制，使细胞周期进程发生阻滞，同时激活修复相关基因的转录，促进细胞对损伤进行修复。由于CHK2在细胞周期中具有重要的负调控作用，许多学者认为CHK2起着抑癌基因的作用，它的异常会导致细胞周期检测点对DNA损伤或复制阻滞不能发挥正常功能，从而引起肿瘤易感性增加，最终导致肿瘤的发生或发展。因此，我们采用聚合酶链式反应连接酶检测反应(polymerase chain reactionligase detection reaction，PCRLDR)技术对新疆汉族人群107例食管癌患者和204例非食管癌患者进行了hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077基因多态性的检测，并分析探讨了其基因多态性与食管癌遗传易感性之间的关系，以期为食管癌的防治提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1研究对象收集2005～2007年间新发的、由5所医院(新疆医科大学第一附属医院、第二附属医院、附属肿瘤医院、伊犁州新华医院、伊犁州友谊医院)经内窥镜、X线及病理确诊的汉族原发性食管癌患者107例作为病例组，其中男性76例，女性31例，并选择与病例无血缘关系、同民族、同性别、年龄相差±5岁、同期住院的非食管癌患者204例作为对照组，其中男性151例，女性53例。所有研究对象采集外周静脉血4 ml，EDTA抗凝，20℃保存至提取DNA。全部调查对象均知情同意。

　　1.2方法

　　1.2.1DNA的提取 改良Miller盐析法[2]提取的DNA溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。

　　1.2.2聚合酶链式反应连接酶检测反应(PCRLDR)分析采用Primer 3.0软件设计特异性引物,见表1。表1hCHK2基因3个SNP位点的上、下游引物序列hCHK2基因SNP位点上游引物(5′3′)下游引物(5′3′)产物长度

　　PCR反应体系：总体积20 μl，含模板DNA 1 μl，1×Buffer缓冲液2 μl，Mg2+0.6 μl，dNTP 2 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl，1×QSolution 4 μl，Primer引物0.4 μl，浓度0.2 pM，加水补足。反应条件：95℃预变性15 min;94℃30 s，57℃退火1 min，72℃延伸7 min，35个循环。根据LDR探针设计原则[3]设计LDR的荧光探针，对该基因待检测的SNP位点，在位点的5’方向根据SNP的碱基类型设计两条特异性探针，每条探针的3’末端碱基分别与此位点的一种等位基因型相对应，此外在该位点的3’方向序列中设计一条末端带有FAM修饰的通用探针(蓝色荧光)，见表2。表2hCHK2基因3个SNP位点LDR连接反应探针序列探针名称探针序列(5′3′)产物长度反应条件：95℃2 min，94℃30 s，60℃2 min，进行35个循环。

　　1.2.3基因分型取LDR产物、内参比荧光ROX和测序胶上样缓冲液(loading buffer)各1 μl等体积混合，应用377型DNA测序仪(ABI，美国)检测结果。以ROX为内参分子量标准，检测不同长度DNA片段的荧光强度，并根据产物片断大小确定基因型。

　　1.3统计学处理全部统计分析在SPSS15.0软件上进行。HardyWeinberg吻合度检验及两组间基因多态性位点的基因型和基因频率比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1PCR实验结果PCR反应产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

　　2.2hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077位点基因分型结果应用ABI公司Model自动测序仪进行序列分析，确定hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077位点基因型，结果见图2。

　　2.3遗传平衡检验经HardyWeinberg遗传平衡检验得出hCHK2基因rs2602431、rs2278022、rs2970077位点所对应的P值均>0.05，符合HardyWeinberg遗传平衡定律[4]，表明研究对象的选择无遗传学偏差，该群体是遗传平衡群体，具有一定的人群代表性。

　　2.4hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077 3个位点等位基因和基因型与食管癌易感性的关系hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077 3个SNP位点基因型在病例组和对照组中的频率分布经χ2检验后，不同位点基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表3。

　　3讨论

　　食管癌(Esophageal Cancer，EC)是全世界最常见的十大恶性肿瘤之一，全世界每年新发病例可达48万人[5]，是发展中国家最常见的一种消化道恶性肿瘤，是危害我国居民健康的主要恶性肿瘤之一[6]。食管癌的发生和发展是一个多因素、多阶段的综合过程，其发病机制目前尚未明确。由于DNA损伤是细胞癌变的前提，为确保DNA损伤后遗传物质的完整性和正确性，机体细胞的DNA修复系统和细胞周期调控系统发挥了重大作用，因此对细胞调控基因hCHK2(细胞周期检测点激酶2)基因的多态性进行了检测。细胞周期检测点激酶2 (checkpoint kinase 2, CHK2)基因位于染色体22q12.1，包含14个外显子，其cDNA全长为1 731 bp。细胞周期检测点在细胞周期调控中起重要作用，可以检测细胞外界或内部的各种异常，从而抑制细胞周期的进程，同时修复损伤或使不能修复的细胞进入凋亡。检测点作为保护机制可确保遗传的稳定性。一旦检测点发生缺陷，带有损伤的细胞可能会异常扩增，使肿瘤发生的风险大大增加。对于hCHK2基因，Zheng等[7]的研究表明，第84密码子A252G多态性与患头颈部鳞状细胞癌的风险性也有关;Jonine等[8]的研究表明，CHEK2*1100delC与乳腺癌的遗传易感性有关，可增加患乳腺癌的风险。但其多态性与食管癌易感性的关系未见报道。本研究通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP、http://www.hapmap.org等人类基因组和单体型数据库，根据SNPs的入选标准，即所选择SNPs的杂合度在中国人群中应>5%，挑选了hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077 3个SNP位点进行其多态性与食管癌易感性关系的研究。本次研究结果显示，hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077 3个SNP位点基因型频率在病例组和对照组中的分布无显著性差异，未发现hCHK2 rs2278022、rs2602431和rs2970077多态性与食管癌的发生有关，单一基因的作用可能是微弱的，要想进一步探明其相互间的关系，尚需扩大样本数，以便作更深入的研究。

　　【参考文献】

　　[1]韦伟, 龚建平, 裘法祖. 细胞周期调控与肿瘤的发生发展[J]. 癌症, 1999, 8:9597.

　　[2]Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J]. Nucleic Acids Res, 1988,16:1215.

　　[3]Luo J, Bergstrom DE, Barany F, et al. Improving the fidelity of thermos thermophilus DNA ligase [J]. Nucleic Acids Res, 1996, 24(14):30713078.

　　[4]陈竺.医学遗传学[M].北京:人民卫生出版社,2005:121128.

　　[5]卫生部卫生统计信息中心, 全国肿瘤防治研究办公室.中国恶性肿瘤危险因素研究[M]. 北京: 中国协和医科大学出版社, 2003:20.

　　[6]李连弟,鲁凤珠,牧人,等.中国恶性肿瘤死亡率20年变化趋势和近期预测分析[J].中华肿瘤杂志,1997,19(1):310.

　　[7]Zheng YX, Li L, Shen HB, et al. Polymorphic hCHK2/hCds1 codon 84 allele and risk of squamous cell carcinoma of the head and neck a casecontrol analysis[J]. Carcinogenesis, 2001, 22(12):20052008.

　　[8]Jonine L, Bernstein L, Sharon N, et al. The CHEK2*1100delC allelic variant and risk of breast cancer: screening results from the breast cancer family registry[J]. Cancer Res, 2006, 15:348352.