DNA修复基因hOGG1多态性与新疆哈萨克族食管癌易感性的研究

　　【关键词】 DNA 修复基因hOGG1多态性 新疆 哈萨克族 食管癌易感性

　　Relationship between hOGG1 gene polymorphism and the susceptibility of

　　esophageal cancer in Kazakh nationality

　　WANG Ying, ZHANG Chen, CHEN Yan, et al

　　(Department of Toxicology, Public Health College, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To determine the association between the human 8hydroxyguanine glycosylase (hOGG1) rs2072668 C/G polymorphism and the susceptibility of esophageal cancer in Kazakh nationality. Methods: A casecontrol study was conducted. The polymorphism of hOGG1 gene at rs2072668 C/G position was analyzed by polymerase chain reactionligase detection reaction (PCRLDR) methods in 132 esophageal cancer cases and 133 noncancer controls. The frequencies of genotype and allele and the association between the genetic polymorphisms and cancer risk were analyzed. Results: The frequency of CC, CG and GG genotypes in the case subjects were 25.2%, 51.3% and 23.5% respectively and in the control subjects were 28.3%, 54.3% and 17.4%. No significant difference was observed in the frequency of hOGG1 genotypes between cases and controls (χ2=1.206, P=0.547). No significantly increased risk for esophageal cancer was observed for those carrying G allele in Kazakh nationality (OR=1.203; 95%CI=0.818～1.770). Conclusion: hOGG1 rs2072668 C/G polymorphism is unlikely to be associated with the susceptibility of esophageal cancer.

　　Key words: human 8hydroxyguanine glycosylase; esophageal cancer; susceptibility; genetic polymorphism; Kazakh nationality

　　人类8羟基鸟嘌呤糖苷酶1(human 8hydroxyguanine glycosylase，hOGG1)是涉及DNA氧化损伤修复的重要基因，可以与含有8羟基鸟嘌呤(8hydroxyguanine，oh8Gua)的双链寡核苷酸特异性结合，参与碱基切除修复过程，维持机体内环境的稳定，从而发挥抗肿瘤作用[1]。研究发现，人群中hOGG1基因具有多态性，导致酶的活性显著下降[23]，与多种恶性肿瘤的发病风险增加有关[46]。因此，我们采用聚合酶链式反应连接酶检测反应(polymerase chain reactionligase detection reaction，PCRLDR)技术分析了新疆地区哈萨克族(以下简称哈族)人群hOGG1 rs2072668 C/G位点多态性与食管癌的关系，以期为食管癌的防治提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1研究对象收集2005～2007年间新发的、由5所医院(新疆医科大学第一附属医院、第二附属医院、附属肿瘤医院、伊犁州新华医院、伊犁州友谊医院)经内窥镜、X线及病理确诊的哈族原发性食管癌患者132例作为病例组，其中男性80例，女性52例，并选择与病例无血缘关系、同民族、同性别、年龄相差±5岁、同期住院的非食管癌患者133例作为对照组，其中男性83例，女性50例。所有研究对象采集外周静脉血4 ml，EDTA抗凝，-20℃保存至提取DNA。全部调查对象均知情同意。

　　1.2方法

　　1.2.1DNA的提取改良Miller盐析法[7]提取的DNA溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。

　　1.2.2聚合酶链式反应连接酶检测反应(PCRLDR)分析hOGG1基因多态性采用Primer 3.0软件设计特异性引物，引物序列：上游引物为 5′TGGGGCTATAAGCAAGATGC3′，下游引物为 5′CCTGGGGCTTGTCTAGGG3′，由上海翼和应用生物技术有限公司合成，PCR产物长度为114 bp。PCR反应体系：总体积20 μl，含模板DNA 1 μl，1×Buffer缓冲液2 μl，Mg2+0.6 μl，dNTP 2 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl，1×QSolution 4 μl，Primer引物0.4 μl，加水补足。反应条件：95℃预变性15 min;94℃30 s，56℃退火1 min，72℃延伸7 min，35个循环。根据LDR探针设计原则[8]设计LDR的荧光探针，对该基因待检测的SNP位点，在位点的5′方向根据SNP的碱基类型设计两条特异性探针，每条探针的3'末端碱基分别与此位点的一种等位基因型相对应，特异性探针1(针对C碱基)为5′TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　AGTCAGCCACCTTTGACAGACACAG3′;特异性探针2(针对G碱基)为5′TTTTTTTTTTTTT

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTCAGCCACC

　　TTTGACAGACACAC3′。此外在该位点的3′方向序列中设计一条末端带有FAM修饰的通用探针(蓝色荧光)，通用探针的5′端磷酸化，以便与特异性探针连接，通用探针：5′PAATGAGCCCTTGTGGAAGAAGGGCATTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　TTTTTTTTTTTTFAM3′。即该基因SNP位点具有3条探针，1条通用探针和2条特异性探针。LDR反应体系：1×Buffer缓冲液1 μl，探针混合液1 μl，连接酶0.05 μl，PCR产物1 μl，PCR专用水补齐10 μl。反应条件：95℃2 min，94℃30 s，60℃2 min，进行35个循环。

　　1.2.3基因分型取LDR产物、内参比荧光ROX和测序胶上样缓冲液(loading buffer)各1 μl等体积混合，应用377型DNA测序仪(ABI，美国)检测结果。以ROX为内参分子量标准，检测不同长度DNA片段的荧光强度，并根据产物片断大小确定基因型。

　　1.3统计学处理全部统计分析在SPSS15.0软件上进行。HardyWeinberg吻合度检验及两组间基因多态性位点的基因型和基因频率比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。以比值比(odds ratio，OR)及95%可信区间(confidence interval，CI)表示各基因型发生食管癌的风险度。

　　2结果

　　2.1PCR实验结果PCR反应产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增出的目的片段长度为114 bp，结果见图1。

　　图1hOGG1 rs2072668位点PCR扩增产物的

　　琼脂糖凝胶电泳图

　　M：Marker，100bp DNA ladder;lane 1、2：PCR产物，114 bp2.2hOGG1 rs2072668位点基因分型结果hOGG1 rs2072668可得到3种基因型：野生纯合子CC，杂合子CG，突变纯合子GG，结果见图2。

　　2.3遗传平衡检验对哈族对照组的基因型频率进行遗传平衡检验，χ2检验结果显示实际数与理论数差异无统计学意义(χ2=0.921，P>0.05)，3种基因型分布频率符合HardyWeinberg遗传平衡定律[9]，具有群体代表性。

　　2.4两组间hOGG1基因型和等位基因分布频率的比较hOGG1 rs2072668C/G位点CC、CG、GG基因型在病例组中的频率分别为25.2%、51.3%和23.5%，在对照组中是28.3%、54.3%和17.4%。经χ2检验后，两组基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=1.206，P=0.547);两组的C、G等位基因频率比较差异也无统计学意义(χ2=0.878，P=0.349)。以C/C基因型作参照，C/G基因型及G/G基因型分别与其相比，均不能增加食管癌发病风险(OR值分别为1.507和1.517，95%CI分别为0.555～2.015和0.676～3.403)，结果见表1。

　　3讨论

　　食管癌是人类常见的恶性肿瘤，全世界每年新发病例可达48万人[10]，是危害我国居民健康的主要恶性肿瘤之一[11]。新疆是中国食管癌高发区之一，13个世居民族中哈萨克族人群(人口约200万)发病率在各民族发病中位居首位，食管癌在新疆地区严重威胁着哈萨克族人民的生命和健康。食管癌的发生和发展是一个多因素、多阶段的综合过程，其发病机制目前尚未明确。遗传易感性是个体发病的内因，各种环境致癌物则为外因。由于DNA的氧化损伤与许多肿瘤的基因突变、细胞癌变发生发展密切相关，因此笔者对DNA氧化损伤修复途径中一种相当重要的修复酶基因hOGG1基因的多态性进行了检测。hOGG1基因位于人染色体3p2526区域内，由7个外显子和6个内含子组成，hOGG1基因编码hOGG α，β两种蛋白，其中αhOGG蛋白主要存在于细胞核，可特异性切除8羟基鸟嘌呤，参与核中DNA的修复，此切除修复能力的降低会导致氧化诱导的突变累积，而导致细胞的恶变[12]。因此，hOGG1基因功能的正常发挥与否应与食管癌的发展进程有一定的联系。对于hOGG1基因，目前主要研究其第7外显子的Ser326Cys多态性与肿瘤易感性的关系，多数学者研究认为hOGG1的表达与其多态性相关，携带Cys/ Cys基因型的人群患肿瘤的风险比较高[13]。本研究通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP、http://www.hapmap.org等人类基因组和单体型数据库，根据SNPs的入选标准即所选择SNPs的杂合度在中国人群中应大于5%，挑选了hOGG1 rs2072668 C/G位点进行其多态性与食管癌易感性关系的研究。结果发现，在病例组和对照组中两者的基因型分布同食管癌的风险关联无统计学意义。SNPs多态性检测技术一直在不断的更新和完善。目前国内外广泛使用的多态性检测技术包括：DNA直接测序技术、限制性酶切片段长度多态性技术(RFLP)、DNA芯片技术(Microarray)、单链构象多态性(SSCP)等。DNA测序技术具有快速、准确、操作简单、自动化水平高等特点，但是成本较高;RFLP操作简单、成本低，但是如果酶切不完全容易造成判断错误，而且此方法只能检测一部分DNA多态性，只有具有酶切位点的SNP或通过引物设计改变几个碱基使SNP产生酶切位点的DNA多态性才能检测，且通量较低，不适合大规模检测。本次研究所采用的LDR基因分型技术在国外已经得到广泛应用，具有特异性高、通用性好、适用范围广等特点[14]，特别适于大片段插入缺失型多态性和单核苷酸多态性的分型，能够大大地节约试剂成本与实验时间。本次研究结果提示，哈族hOGG1 rs2072668 C/G位点基因型频率在病例组和对照组中的分布无显著差异，未发现哈族hOGG1 rs2072668多态性与食管癌癌易感性有统计学意义的关联，单一基因的作用可能是微弱的，要想进一步探明其相互间的关系，尚需扩大样本数，以便作更深入的研究。

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