CYP2A6基因多态性与食管癌易感性的关系

　　【关键词】 CYP2A6基因多态性 食管癌 易感性

　　Relationship between CYP2A6 gene polymorphism and

　　susceptibility of esophageal cancer DENG Yanchao, ZHANG Chen, CHEN Yan , et al

　　(First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)Abstract: Objective: To determine the association between cytochrome P450 2A6 rs8192720 polymorphism and the susceptibility of esophageal cancer in Han nationality. Methods: A casecontrol study was conducted. The polymorphism of CYP2A6 gene at rs8192720 A/G position was analyzed by polymerase chain reactionligase detection reaction (PCRLDR) methods in 107 esophageal cancer cases and 204 noncancer controls. The frequencies of genotype and allele and the association between the genetic polymorphisms and cancer risk were analyzed. Results: The frequency of GG, GA and AA genotypes in the case subjects were 66.35%， 32.69%， 0.96% respectively and in the control subjects were 69.59%， 27.84%， 2.58%. No significant difference was observed in the frequency of CYP2A6 genotypes between cases and controls (χ2=1.45, P=0.48). The genotype of GG and GA+AA has not significance between the cases and controls (χ2=0.33，P=0.57). Conclusion: CYp2A6 rs8192720A/G polymorphism is unlikely to be associated with the susceptibility to esophageal cancer.

　　Key words: CYP2A6; esophageal cancer; susceptibility; genetic polymorphism

　　近年来，有关代谢酶基因多态性与肿瘤易感性关系的研究己成为肿瘤研究领域的热点课题。CYPⅡ家族是目前已知的CYP同功酶中数量最多，结构最复杂的家族，其中CYP2A基因家族位于人体19号染色体长臂19q12和19ql3.2之间，约350 kb大小。它包括3个完整基因：CYP2A6、CYP2A13和CYP2A7，以及两个CYP2A7假基因。这些基因都具有含9个外显子的典型CYP2A基因亚族结构。其中CYP2A6是最重要的成员，编码香豆素7羟化酶(eoumarin7hydroxide)，在许多外源性化学物质的代谢中起重要作用，并参与许多前致癌物的代谢活化。目前已知烟草中重要的致癌物尼古丁在人体内经C氧化(Coxidation)生成可铁宁(cotinine)过程主要是通过CYP2A6酶催化的[1]。由于CYP2A6具有多态现象，而这种多态性也就决定了其功能上的差异，所以研究CYP2A6基因多态性与食管癌遗传易感性，对食管癌的早期诊断和防治都具有重要意义。本研究采用聚合酶链式反应连接酶检测反应(polymerase chain reactionligase detection reaction，PCRLDR)技术对新疆汉族人群107例食管癌患者和204例非食管癌患者进行了CYP2A6 rs 8192720基因多态性的检测，并分析探讨了CYP2A6 rs 8192720基因多态性与食管癌遗传易感性之间的关系。

　　1材料与方法

　　1.1研究对象收集2005～2007年间新发的、由5所医院(新疆医科大学第一附属医院、第二附属医院、附属肿瘤医院、伊犁州新华医院、伊犁州友谊医院)经内窥镜、X线及病理确诊的汉族原发性食管癌患者107例作为病例组，其中男性76例，女性31例，并选择与病例无血缘关系、同民族、同性别、年龄相差±5岁、同期住院的非食管癌患者204例作为对照组，其中男性151例，女性53例。所有研究对象采集外周静脉血4 ml，EDTA抗凝，-20℃保存至提取DNA。全部调查对象均知情同意。

　　1.2方法

　　1.2.1DNA的提取改良Miller盐析法[2]提取的DNA溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。

　　1.2.2聚合酶链式反应连接酶检测反应(PCRLDR)分析CYP2A6 rs8192720多态性采用Primer 3.0软件设计特异性引物，引物序列：上游引物为 5′CCCTTGCTCTTCCTCTGCT3′，下游引物为 5′AGCCAAAGTCCATCCCTCTT3′，PCR产物长度为172 bp。PCR反应体系：总体积20 μl，含模板DNA 1 μl，1×Buffer缓冲液2 μl，Mg2+0.6 μl，dNTP 2 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl，1×QSolution 4 μl，Primer引物0.4 μl，浓度0.2 pM，加水补足。反应条件：95℃预变性15 min;94℃30 s，56℃退火1 min，72℃延伸7 min，35个循环。根据LDR探针设计原则[3]设计LDR的荧光探针，对该基因待检测的SNP位点，在位点的5′方向根据SNP的碱基类型设计两条特异性探针，每条探针的3′末端碱基分别与此位点的一种等位基因型相对应，特异性探针1(针对A碱基)为5′TTTTTTTT

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCA

　　TGCTGGCCTCAGGGATGCTTT3′;特异性探针2(针对G碱基)为5′TTTTTTTTTTTTTTTTT

　　TTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGCTGGC

　　CTCAGGGATGCTTC3′。此外在该位点的3'方向序列中设计一条末端带有FAM修饰的通用探针(蓝色荧光)，通用探针的5′端磷酸化，以便与特异性探针连接，通用探针：5′PTGGTGGCCTTGCTGGTCTGCCTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT

　　TTTTTTTTTTTTTTTTFAM3′。即该基因SNP位点具有3条探针，1条通用探针和2条特异性探针。LDR反应体系：1×Buffer缓冲液1 μl，探针混合液1 μl，连接酶0.05 μl，PCR产物1 μl，PCR专用水补齐10 μl。反应条件：95℃2 min，94℃30 s，60℃2 min，进行35个循环。

　　1.2.3基因分型取LDR产物、内参比荧光ROX和测序胶上样缓冲液(loading buffer)各1μl等体积混合，应用377型DNA测序仪(ABI，美国)检测结果。以ROX为内参分子量标准，检测不同长度DNA片段的荧光强度，并根据产物片断大小确定基因型。

　　1.3统计学处理全部统计分析在SPSS15.0软件上进行。HardyWeinberg吻合度检验及两组间基因多态性位点的基因型和基因频率比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1PCR实验结果PCR反应产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增出的目的片段长度为172 bp，结果见图1。

　　图1CYP2A6 rs 8192720位点PCR扩增产物的

　　琼脂糖凝胶电泳图M：Marker, 100 bp DNA ladder;lane 1、2、3：PCR产物，172 bp2.2CYP2A6 rs8192720位点基因分型结果CYP2A6 rs8192720可得到3种基因型：AA、AG和GG，结果见图2。

　　2.3遗传平衡检验对汉族对照组的等位基因和基因型频率进行遗传平衡检验，χ2检验结果显示实际数与理论数差异无统计学意义(χ2=0.00，P>0.05)，3种基因型分布频率符合HardyWeinberg遗传平衡定律[4]，具有群体代表性。

　　图2CYP2A6 rs8192720分型结果2.4CYP2A6 rs8192720位点等位基因和基因型与食管癌易感性的关系CYP2A6 rs8192720A/G位点GG、GA、AA基因型在病例组中的频率分别为66.35%、32.69%和0.96%，在对照组中为69.59%、27.84%和2.58%。经χ2检验后，两组基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=1.45，P=0.48);由于AA基因型的分布频率较少，把GA和AA基因型进行了合并，合并后经χ2检验，结果也无统计学意义(χ2=0.33，P=0.57);两组的G、A等位基因频率比较也无统计学意义(χ2=0.06，P=0.80)，结果见表1。表1CYP2A6 rs8192720基因多态性与食管癌

　　3讨论

　　食管癌(Esophageal Cancer，EC)是全世界最常见的十大恶性肿瘤之一，是发展中国家最常见的一种消化道恶性肿瘤，是严重危害人类健康的疾病[5]。食管癌的病因和发病机制极为复杂，流行病学的调查表明，食管癌的发生是一个涉及多因素、多基因变异积累及相互作用的复杂过程，它不但与环境因素有关，而且与遗传因素相关。由于CYP2A6编码香豆素7羟化酶(eoumarin7hydroxide)在许多外源性化学物质的代谢中起重要作用，并参与许多前致癌物的代谢活化。环境中绝大多数的化学致癌物多为前致癌物，它们需经Ⅰ相代谢酶(如：CYP450s)代谢活化后才具有致癌性。肿瘤的易感性可能与前致癌物的代谢活化及失活之间失衡相关。因此，本研究就CYP2A6 rs8192720多态性与食管癌易感性的关系进行了探讨。CYP2A6基因位于19号染色体q12q13.2，含有6 000个碱基对，包含了9个外显子，CYP2A6约占整个P450酶系统的5%，香豆素是CYP2A6特异性的底物，能被CYP2A6代谢为7OH香豆素排出体外[6]。CYP2A6同时也是一个与人体健康密切相关的酶，它能将许多致癌原如黄曲酶毒素B1、烟草中大量的亚硝胺致癌原，如N亚硝基二甲胺、甲基亚硝胺基吡啶酮(NNK)等激活为强致癌物，与肺癌罹患率有很强的相关性[7-8]。近年来，有研究发现CYP2A6缺失型患肺癌的危险性大[9]，但研究结果不一致[10-11]。但有一个合理的假说，即和体内亚硝胺类致癌物的第1次清除有关。CYP2A6是肝中亚硝胺代谢较重要的一种酶，当CYP2A6基因缺失时抑制了亚硝胺的第1次清除，导致在肺和食管中致癌物浓度增高。另一方面，在这些靶器官中亚硝胺的积累可被其它CYP酶激活如CYP2E1，或其它途径如脂加氧酶激活。但是这种说法仅限于不吸烟者，因为亚硝胺若从口中进入，在到达肺和食管之前首先在肝中代谢。另外，动物实验证明亚硝胺在肝中的第1次清除受抑制时，随之而来的是肿瘤发病率的升高。同时给予亚硝胺和其氧化的竞争性抑制剂乙醇，在大鼠体内显著提高了N亚硝胺二乙胺(NDEA)诱发食管癌的发病率[12]。本研究通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP、http://www.hapmap.org等人类基因组和单体型数据库，根据SNPs的入选标准即所选择SNPs的杂合度在中国人群中应大于5%，挑选了CYP2A6 rs8192720 A/G位点进行其多态性与食管癌易感性关系的研究。结果发现，CYP2A6 rs8192720A/G位点GG、GA、AA基因型在病例组中的频率分别为66.35%、32.69%和0.96%，在对照组中为69.59%、27.84%和2.58%。经χ2检验后，两组基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=1.45，P=0.48);GG和GA+AA基因型在病例组和对照组中分布差异也无统计学意义(χ2=0.33，P=0.57)。目前，关于基因多态性与肿瘤的易感性多倾向于研究多个基因之间的联合作用，单一基因的作用可能是微弱的，要想进一步探明其相互间的关系，尚需做进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]Messina ES, Tyndale RF, Sellers EM. A major role for CYP2A6 in nieotine Coxidation by human liver mierosomes[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1997, 282:16081614.

　　[2]Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J]. Nucleic Acids Res, 1988, 16:1215.

　　[3]Luo J, Bergstrom DE, Barany F, et al. Improving the fidelity of thermos thermophilus DNA ligase [J]. Nucleic Acids Res, 1996, 24(14):30713078.

　　[4]陈竺. 医学遗传学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2005:121128.

　　[5]卫生部卫生统计信息中心, 全国肿瘤防治研究办公室.中国恶性肿瘤危险因素研究[M].北京: 中国协和医科大学出版社, 2003: 235248.

　　[6]李晓宇, 刘皋林. CYP450酶特性及其应用研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2008 , 13(8):942946.

　　[7]Fujita K, Kamataki T. Screening of organosulfur compounds as inhibitors of human CYP2A6[J]. Drug Metab Dispos, 2001, 29(7):983989.

　　[8]Ariyoshi N, Miyamoto M, Umetsu Y, et al. Genetic polymorphism of CYP2A6 gene and tobaccoinduced lung cancer risk in male smokers[J]. Cancer Res, 2002, 11(9):890917.

　　[9]Tan W, Chen GF, Xing DY, et al. Frequency of CYP2A6 gene deletion and its relation to risk of lung and esophageal cancer in theChinese population[J]. Int J Cancer, 2001, 95(2):96101.

　　[10]Yokoi T,Kamataki T.Genetic polymorphism of drug metabolizing enzymes: new mutations in CYP2D6 and CYP2A6 genes in Japanese[J].Pharm Res,1998,15(4):517524.

　　[11]顾艳斐, 张树才, 赖百塘, 等. CYP2A6基因多态性与肺癌易感性关系的研究[J]. 中国肺癌杂志, 2005, 8(4):297299.

　　[12]Anderson L M, Chhabra S K, Nerurkar PV, et al. Alcoholrelated cancer risk: a toxicokinetic hypothesis[J]. Alcohol, 1995, 12:97104.