琐琐葡萄多糖中糖醛酸含量的测定

　　【关键词】 琐琐葡萄多糖 糖醛酸 含量测定

　　(Department of Toxicology, College of Public Health, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830011, China)Abstract: Objective: To determine the galacturonic acid content of the polysaccharides from Vitis vinifera L. (VVP). Methods: The method with mhydroxydiphenyl was used. The amount of tetraborate/H2SO4, the boiling time, mhydroxydiphenyl and the interference by neutral sugar were studied. Results: The method we employed is not affected by the neutral sugars and the average content of galacturonic acid in VVP is 38.17%, RSD is 1.65%. Conclusion: As being simple and accurate, the method of mhydroxydiphenyl can be well used for the determination of galacturonic acid in VVP.

　　Key words: Vitis vinifera L. polysaccharides; uronic acid; quantitative determination; method of mhydroxydiphenyl琐琐葡萄(Vitis viniferal L.)

     属葡萄科小无核红葡萄品系植物，药食兼用，主产于新疆吐鲁番、和田、鄯善等地[1]。作为药用果实，琐琐葡萄具有健脾胃、理肺、生津、养血等作用;维吾尔医学应用琐琐葡萄治疗脾胃不和、头晕腰酸、神志不安等，民间用于治疗小儿麻疹、肝炎等症[2]，其药用功效在《神农本草经》、《本草纲目》中均有记述。多糖(polysaccharides)是自然界中含量最丰富的生物聚合物，也是构成生命活动的四大基本物质之一，近年来，多糖及其衍生物作为组织支持物质和能量来源的传统观念已被突破，作为一种非细胞毒物质，它还具有调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、抗辐射等多种生物活性，成为近年来天药研究的热点课题之一[3]。多糖是琐琐葡萄的主要有效成分之一[4]，研究表明具有特殊生理活性的多糖其糖醛酸含量一般较高，作为糖分子中6位的羟甲基氧化成羧基的产物，糖醛酸本身或含有糖醛酸结构单元的低聚糖或多糖常显示出十分重要的生物活性，尤其对于从天然植物中提取得到的多糖，确定其结构中是否含有糖醛酸残基具有极为重要的意义[5]。因此本研究采用间羟基联苯法对琐琐葡萄多糖中的半乳糖醛酸进行含量测定，以期为琐琐葡萄多糖的结构分析和生物学活性研究提供研究基础。

　　1主要材料、仪器及设备

　　1.1主要材料琐琐葡萄药材：购自新疆维吾尔自治区吐鲁番市维吾尔医药市场，经专家鉴定确为琐琐葡萄(Vitis viniferal L.)的成熟果实。琐琐葡萄多糖：本实验室自制;半乳糖醛酸、间羟基联苯购自中国药品生物制品检定所;95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇、三氯甲烷、EDTA、浓硫酸、葡萄糖、氢氧化钠和四硼酸钠均为国产分析纯试剂。

　　1.2仪器及设备DZTW调温电热套(北京永光明医疗仪器厂)，DKS24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，RE52旋转式蒸发仪(上海安亭实验仪器有限公司)，SHBⅢ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，THZ82A 气浴恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)，透析袋，电子分析天平，分液漏斗，布氏漏斗，UV2501PC型双光束紫外分光光度计(日本岛津公司)，XW80旋涡混合器(上海第一医学院仪器厂)。

　　2方法与结果

　　2.1琐琐葡萄多糖样品的制备称取琐琐葡萄药材400 g，粉碎，过20目筛，加10倍体积的蒸馏水回流提取2次，每次3 h，提取液合并减压，浓缩至膏状，加入5倍体积的95%乙醇，静置12 h。静置液体经抽滤后取沉淀部分经无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤，干燥得多糖粗品40 g。多糖粗品经Sevage法除蛋白，水相反复透析，得精制多糖40 mg。

　　2.2试剂的配制(1)半乳糖醛酸标准溶液：称取干燥至恒重的半乳糖醛酸标准品25.00 mg，加水溶解并定容至25 ml，混匀，制备成1.00 mg/ml的标准溶液。(2)四硼酸钠/硫酸溶液：准确称取0.478 g 四硼酸钠溶解于100 ml浓硫酸中，备用。(3)间羟基联苯溶液：准确称取0.15 g 间羟基联苯溶解于5 mg/ml 氢氧化钠溶液中，定容至100 ml，其质量浓度为1.50 mg/ml。(4)葡萄糖溶液：准确称取葡萄糖25.00 mg，加水溶解并定容至25 ml，混匀，其质量浓度为1.00 mg/ml。

　　2.3试验方法及最大吸收波长的选择取半乳糖醛酸标准溶液(1.00 mg/ml)0.50 ml，置10 ml容量瓶中，以水定容至刻度，摇匀( 质量浓度为0.05 mg/ml)。量取该溶液1.00 ml 置于20 ml具塞试管中,于冰水浴中，缓慢加入四硼酸钠/硫酸溶液5 ml，待全部加完后，用旋涡混合器混匀，于沸水浴中加热5 min，冰水浴中冷却后加入1.50 mg/ml 间羟基联苯溶液100 μl，混匀后振摇5 min，静置待气泡除尽。以1 ml 蒸馏水同上操作制得空白液调零，于200～800 nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长为525 nm。

　　2.4试验条件的考察[6]该测定方法中影响吸光度A的因素分别是四硼酸钠/硫酸溶液用量、加酸后沸水浴时间和间羟基联苯溶液用量。

　　2.4.1四硼酸钠/硫酸溶液用量考察多聚半乳糖醛酸在热的浓硫酸作用下水解为半乳糖醛酸单体，浓硫酸用量影响着水解反应的程度。在硫酸中加入一定量的四硼酸钠可增加半乳糖醛酸显色的敏感性。因此，本研究考察了四硼酸钠/硫酸溶液用量对测定的影响，结果如表1所示(半乳糖醛酸标准溶液1.00 ml，四硼酸钠/硫酸溶液用量为4.0～6.0 ml，沸水浴加热5 min，间羟基联苯溶液100 μl)。

　　表1不同四硼酸钠/硫酸溶液用量测得的吸光度四硼酸钠/硫酸溶液(ml)4.04.55.05.56.0吸光度0.2810.3680.5410.6890.598从表1中数据可看出，随着四硼酸钠/硫酸溶液用量的增加，溶液吸光度相应增高，但是，过量的四硼酸钠/硫酸溶液使溶液中衍生物的浓度降低，吸光度反而下降。由此表明，在本实验条件下四硼酸钠/硫酸溶液用量的适宜值为5.5 ml，其吸光度最大。

　　2.4.2加酸后沸水浴加热时间考察四硼酸钠/硫酸溶液与多聚半乳糖醛酸的水解反应须在沸水浴加热的条件下进行，水浴时间对反应的影响见表2(半乳糖醛酸标准溶液1.00 ml，四硼酸钠/硫酸溶液5.0 ml，沸水浴加热时间2～15 min，间羟基联苯溶液100 μl)。表2不同水浴时间测得的吸光度水浴时间从表2数据可看出，水浴加热5 min反应完全，吸光度最大且此后反应趋于基本平衡。因此，沸水浴加热5 min是较适宜的。

　　2.4.3间羟基联苯用量考察间羟基联苯可与多聚半乳糖醛酸的水解产物反应，将其转化衍生后显色。间羟基联苯用量对吸光度的影响见表3(半乳糖醛酸标准溶液1.00 ml，四硼酸钠/硫酸溶液5.00 ml，沸水浴5 min，间羟基联苯溶液用量为70～130 μl)。表3不同间羟基联苯用量测得的吸光度间羟基联苯溶液从表3数据表明，加入100 μl间羟基联苯溶液时溶液吸光度值比较稳定，为最佳用量。依据以上试验结果，确定本次含量测定的最佳反应条件为：四硼酸钠/硫酸溶液用量5.5 ml，沸水浴时间5 min，1.5 mg/ml间羟基联苯溶液用量100 μl。

　　2.5中性糖对糖醛酸含量测定的影响经测定，琐琐葡萄多糖提取物中含有中性糖,运用传统的“硫酸咔唑法”对天然产物中的糖醛酸进行定量分析时，中性糖可与硫酸咔唑形成棕色衍生物，干扰测定结果的准确性[6]。因此，在采用“间羟基联苯法”测定糖醛酸含量时，需考察中性糖(以葡萄糖为例)对测定结果的影响，即在一定浓度半乳糖醛酸标准溶液中，添加不同质量的中性糖，以考查不同质量浓度的中性糖对半乳糖醛酸溶液吸光度是否有影响，结果见表4 (溶液中半乳糖醛酸质量浓度为50 μg/ml)。

　　表4中性糖对测定结果的影响葡萄糖质量浓度(μg/ml)050100150吸光度0.3180.3370.3200.346从表4数据可看出，当中性糖含量增加时，吸光度值仅发生微小变化，该结果表明，采用间羟基联苯法测定糖醛酸含量时，中性糖对测定结果的影响很小。

　　2.6标准曲线的制备取半乳糖醛酸标准溶液(1.00 mg/ml)0.50 ml，置10 ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀( 质量浓度为0.05 mg/ml)。分别取该浓度的半乳糖醛酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 ml置于20 ml具塞试管中，于冰水浴中加入四硼酸钠/硫酸溶液5.5 ml，用旋涡混合器混匀，于沸水浴中加热5 min，冰水浴中冷却后加入1.5 mg/ml间羟基联苯溶液100 μl，混匀后振摇5 min，静置。以1 ml蒸馏水同上操作制得空白液调零，在525 nm波长处测定吸光度。以标准糖醛酸含量(μg)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线(图1)，并拟合标准曲线的回归方程为：Y=0.014 94X-0.003 93 (R=0.999 4)，表明半乳糖醛酸标准品在5～30 μg范围内呈良好的线性关系。

　　图1半乳糖醛酸对照品溶液的标准曲线2.7稳定性试验、精密度试验及加标回收率试验

　　2.7.1稳定性试验准确称取样品5 mg置100 ml容量瓶，加水溶解定容至刻度(浓度50 μg/ml。取该溶液1 ml按“标准曲线的制备”项下操作，每隔5 min测定一次吸光度，表5中结果显示，1 h内吸光度值基本维持稳定。表5稳定性试验结果显色后不同

　　2.7.2精密度试验取同批样品溶液(50 μg/ml)，按“标准曲线的制备”项重复操作5次并分别测定吸光度，RSD为2.50%，结果见表6。

　　表6精密度试验结果测定次数12345平均值RSD(%)吸光度0.2060.2020.2130.2150.2090.2092.50

　　2.7.3加标回收率试验取样品10 mg置100 ml容量瓶中，加水溶解定容至刻度(浓度100 μg/ml)。取该溶液1 ml按“标准曲线的制备”项下操作，用标准添加法分别添加不同质量的半乳糖醛酸标准品，测得间羟基联苯法的平均回收率为99.82%，RSD为1.82%，结果见表7。

　　2.8样品含量测定分别称取样品1和样品2各5 mg置100 ml容量瓶中，加水溶解定容至刻度(浓度50 μg/ml)。分别取该浓度溶液1 ml按“标准曲线的制备”项下操作，每份样品平行测定3次，结果见表8。 表7加标回收率试验结果样品中糖醛酸含量表8VVP中样品含量测定结果样品编号吸光度值半乳糖糖醛酸

　　3结论

　　间羟基联苯法是糖醛酸含量测定中比较成熟的方法，然而其测定条件各文献报道间差异较大，因此，本研究对影响测定的主要因素进行了逐一考察，筛选出最佳试验条件，进一步提高了实验结果的科学性和准确性。此外，天然药物提取的多糖以酸性杂多糖的形式存在较多，由于中性糖、糖醛酸并不是独立存在，它们可能存在于同一糖链中，无法将它们分离，在分别测定含量时可能存在相互干扰，本试验结果表明，采用间羟基联苯法测定糖醛酸含量时，中性糖对测定结果的影响很小。 精密度、稳定性试验和加标回收率试验的结果表明间羟基联苯法操作简便灵敏，样品稳定性、重现性较好，回收率高，适合于对琐琐葡萄多糖中糖醛酸含量进行测定，并最终测得琐琐葡萄多糖中糖醛酸的平均百分含量为38.17%，RSD为1.65%，为琐琐葡萄多糖的构效关系研究和生物学活性的探索开辟了新的思路和方向。

　　【参考文献】

　　[1]刘勇民.维吾尔药志[M].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1999:496.

　　[2]新疆维吾尔自治区卫生厅.维吾尔药材标准(上册)[S].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1993:41.

　　[3]孙长灏.营养与食品卫生学[M].北京:人民卫生出版社,2001：10.

　　[4]刘涛,马龙,赵军,等.琐琐葡萄多糖的提取及抗氧化能力研究[J].新疆医科大学学报,2007,30(11):12301232.

　　[5]刘翠平,董群,方积年.一种判定多糖中有无糖醛酸残基的简易新方法[J].中草药,2001,32(5):404407.

　　[6]高林,施秀芳,张文博,等. MPC中糖醛酸的含量测定[J].化学工业与工程, 2005, 22(6):487489.