蛋白酶体抑制剂MG132对体外人U87胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

　　【摘要】 目的 探讨蛋白酶体抑制剂MG132对体外人U87胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法 分别以不同浓度(0、2.5、5、10和20 μmol/L)的MG132培养U87胶质瘤细胞，通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同培养时间(12、24、48、72 h)对U87胶质瘤细胞增殖的影响，流式细胞仪分析MG132对U87胶质瘤细胞凋亡的影响，HE染色观察细胞形态学变化。结果 通过与正常对照组比较，2.5～20 μmol/L浓度的MG132在12、24、48及72 h均可抑制U87细胞增殖并诱导其凋亡，并在一定范围内呈时间和剂量依赖性;各亚组与对照组差异具有统计学意义(P<0.05);形态学检查呈现凋亡细胞的特征。结论 MG132可抑制U87胶质瘤细胞增殖并诱导其凋亡，在一定范围内呈时间和剂量依赖性。

　　【关键词】 蛋白酶体抑制剂MG132;U87胶质瘤细胞;细胞凋亡

　　Inhibition of Proliferation and Apoptosis on U87 Glioma Cell in vitro by Proteasome Inhibitor MG132

　　FAN Junqiang，ZHAO Yonggang,FAN Bo,et al

　　First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China

　　Abstract:Objective To explore the effects of proteasome inhibitor MG132 on proliferation, apoptosis of U87 glioma cells in vitro. Methods U87 glioma cells were cultured with different concentrations of proteasome inhibitor MG132 (0，2.5，5，10 and 20 μmol/L) . Cell viability was determined by MTT assay at different cultured periods(12，24，48，72),apoptosis rates were measured by flow cytometry (FCM)，and HE were used to detect the morphological changes of apoptotic cells. Results Compared with normal control，exposure to MG132 had a antiproliferative effect on U87 glioma cells and induced U87 glioma cell apoptosis，and was in a certain range of time and dosedependence; In each subgroup and control group，differences had statistical significance(P<0.05). Conclusion Proteasome inhibitor MG132 can inhibit U87 glioma cell proliferation and induce U87 glioma cell apoptosis，in a certain range time and dosedependent manner.

　　Key words:proteasome inhibitor MG132;U87 glioma cell;cell apoptosis

　　胶质母细胞瘤在神经上皮性肿瘤中占22.3%，有报告占颅内肿瘤的10.2%，仅次于星形细胞瘤而居第2位，其恶性程度高、生长快、术后易复发，目前多以手术切除为主，术后辅以放疗、化疗、免疫治疗等，但均未能明显改善患者的预后[1]。人胶质瘤细胞含有异常高水平的蛋白酶体活性，且这种活性和胶质瘤的恶性程度高度相关[2，3]。MG132是一种蛋白酶体特异性抑制剂，通过抑制蛋白酶体活性，阻断泛素—蛋白酶体通路(ubiquitinproteasome pathway，UPP)，从而阻碍细胞内的生化过程，有文献报道MG132能够抑制胃癌细胞的增殖并且诱导其凋亡[4]，但是尚未见MG132对U87胶质瘤细胞增殖和凋亡影响的报道。本实验首次在体外研究MG132对人U87胶质瘤细胞的影响，探讨其与人胶质瘤细胞增殖及凋亡的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料

　　U87胶质瘤细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，MG132为德国默克公司产品，DMEM细胞培养基为美国英杰生命技术公司产品,MTT、PI为美国Sigma公司产品。

　　1.2 方法

　　U87胶质瘤细胞复苏后培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃5%CO2培养箱中培养并传代。实验分5组，实验组细胞培养液中加入不同浓度的MG132，浓度分别为2.5、5、10和20 μmol/L，对照组为不加MG132的U87胶质瘤细胞，观察药物作用不同时间(12、24、48和72 h)对细胞增殖和细胞凋亡的影响。

　　1.3 细胞增殖活性检测

　　选择对数生长期细胞,调整细胞数,接种于96孔板，每孔加100 μL。24 h后，设不加药物的对照组，和每孔分别加入浓度为2.5、5、10和20 μmol/L MG132的实验组,每组设6个复孔，分别培养12、24、48、72 h 后，每孔加入MTT 溶液(5 g/L) 20 μL，37 ℃继续培养4 h，吸弃上清，加入二甲基亚砜100 μL，在平板摇床微振荡20 min后，用全自动酶标仪测每孔光密度值(A)，各平行孔取均值后计算细胞抑制率。

　　1.4 HE染色细胞形态学观察

　　选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化贴壁细胞成单细胞悬液，按每孔2×105个细胞接种于放有灭菌的涂有多聚赖氨酸的盖玻片6孔培养板中爬片，加入MG132，不加药物孔为对照组。细胞继续培养24 h后，将带有U87胶质瘤细胞的盖玻片取出于4%多聚甲醛中固定10 min，行HE(苏木素伊红)染色，光镜下观察。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率

　　按上述步骤处理细胞后，收集各组细胞，PBS洗2次,用70%冷乙醇固定，离心弃乙醇，重悬，加入RNA酶60 μL(终浓度为50 mg/L)，碘化丙啶( PI) 150 μL，混匀，4 ℃避光放置30 min，流式细胞仪上机检测，用MultiCycleAV软件进行凋亡率分析，每组设置5个平行样。

　　1.6 统计学处理

　　实验数据采用SPSS 10.0 统计软件进行方差分析和LSD检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 细胞增殖活性检测

　　U87胶质瘤细胞经不同浓度MG132 处理后，4个药物浓度组细胞12 h 即表现出增殖抑制作用，且随药物浓度的增加其抑制作用逐渐增强。见表1 。表1 不同浓度MG132作用不同时间后U87胶质瘤细胞的增殖抑制率比较(±s)(略)

　　与对照组相比P<0.052.2 HE染色细胞形态学观察 对照组U87胶质瘤细胞光镜下可见生长密度大，呈梭形或三角形，核分裂像多，10 μmol/L实验组可见U87 胶质瘤细胞逐渐减少，体积变小，细胞突触变短、变圆，胞浆浓缩深染，胞核染色质致密浓缩, 且胞核偏向一侧，呈凋亡形态学改变。见图1、2。图1 对照组图2 10 μmol/L组(略)

　　2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率

　　对照组细胞凋亡率较低, 而经不同浓度MG132 处理U87胶质瘤细胞后，12、24、48和72 h 各个药物处理组其细胞凋亡率均显著高于正常对照组(P<0.05)。10 μmol/L 浓度组细胞凋亡率较高，见表2。表2 不同浓度的MG132 处理后U87 胶质瘤细胞的凋亡率(±s)(略)

　　3 讨论

　　脑胶质细胞瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，研究显示癌基因的异常激活、高表达和(或)抑癌基因的缺失、失活是其产生、发展的主要原因[5]。抑癌基因的缺失、失活与异常高水平的蛋白酶体活性高度相关，且与胶质瘤的恶性程度高度相关。U87胶质瘤细胞株源自人脑胶质母细胞瘤，恶性程度高。UPP是由26S蛋白酶体和泛素酶(E1、E2、E3)等多个催化活性蛋白酶组成的蛋白水解酶复合体，是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一，对细胞增殖、细胞周期的调节等具有重要作用[6]。MG132是一种有效、可逆的醛基肽类特异性蛋白酶体抑制剂，能阻止26s蛋白酶体对泛素结合蛋白的降解、抑制蛋白酶体活性，阻断UPP。当细胞生命活动过程中产生异常蛋白不能被及时降解时，这些异常蛋白就会在细胞内彼此黏连在一起，形成具有细胞毒性的蛋白聚集物，此时就可能阻碍细胞内的生化过程，从而抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡[7,8]。

　　本研究采用MTT法检测结果显示，MG132在一定的浓度和作用时间范围内对U87胶质瘤细胞具有抑制增殖的作用，且抑制增殖作用呈剂量—效应和时间—效应关系。当药物浓度大于10 μmol/L时，检测初步显示细胞抑制增殖作用较为明显。流式细胞仪检测结果显示在一定的浓度和作用时间范围内MG132对U87胶质瘤细胞具有诱导凋亡的作用，当药物浓度为10 μmol/L时细胞凋亡率为最大。本实验HE染色细胞形态学观察显示，对照组U87胶质瘤细胞光镜下可见生长密度大，呈梭形或三角形，核分裂像多;U87胶质瘤细胞经10 μmol/LMG132作用24 h后HE染色光镜下观察呈现典型的细胞凋亡的形态学变化，细胞逐渐减少，体积变小，细胞突触变短，变圆，胞浆浓缩深染，胞核染色质致密浓缩，且胞核偏向一侧，呈凋亡形态学改变。

　　有研究表明，抑制蛋白酶体活性，阻断UPP后对胶质瘤细胞的抑制增殖与诱导凋亡作用可能与下列机制有关：①一些抑癌基因,如p53和p27等在肿瘤细胞中缺失、失活与蛋白酶体活性增强而导致其降解增加[9]，因此阻断蛋白酶体途径可以使其代谢减少而更好地发挥抗肿瘤作用;②当异常蛋白质降解减少而在细胞内异常积聚时就可能促进凋亡信号通路的启动，导致细胞凋亡[10]。

　　以上表明，蛋白酶体抑制剂MG132对体外U87胶质瘤细胞具有抑制其增殖并能诱导其凋亡的作用，但关于蛋白酶体抑制剂MG132抑制肿瘤增殖及其诱导凋亡作用的确切机制还有待于进一步研究。

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