5-杂氮脱氧胞嘧啶对卵巢癌细胞株增殖和肿瘤特异性抗原表达的影响

　　【摘要】 目的 探讨 5-杂氮脱氧胞嘧啶(DAC)对卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1增殖和肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE表达的影响。方法 将处于对数生长期的卵巢癌细胞系与5-杂氮脱氧胞嘧啶(DAC)共同培养，观察细胞生长指数并利用流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡情况，应用RTPCR法检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1在DAC作用前后肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE表达的变化。结果 DAC能抑制卵巢癌细胞株的增殖，使大多数细胞阻滞在G0期，并使肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE阳性表达率提高。结论 DAC可以提高卵巢癌细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE的阳性表达率，扩大卵巢癌免疫治疗的应用范围。

　　【关键词】 去甲基化;5-杂氮脱氧胞嘧啶;卵巢癌;肿瘤特异性抗原

　　Effect of 5aza2′deoxycytidine in Proliferation of Ovarian Cancer Cell Lines on Expression of Tumor Specific Antigen

　　ZHOU Xiaoliang,ZHANG Shiqian,ZHANG Xiaowei

　　First Affilliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China

　　Abstract:Objective To investigate the effect of 5aza2′deoxycytidine in proliferation of ovarian cancer cell lines and expression of tumor specific antigen MAGE BAGE GAGE. Methods Ovarian cancer cell lines were treated with 5aza2′deoxycytidine(DAC) in coculture, the growth curves were observed; the cell cycle was detected by flow cytometry(FCM);the MAGE BAGE GAGE gene expression pattern before and after DAC treatment was measured by RTPCR. Results The treatment of DAC inhibited the proliferation of ovarian cancer cells，the growth of most cells were stopped in G1/S phases after drug treatment，the gene expression after treatment was more frequent than before. Conclusion Treatment of DAC can elevate the expression of tumor specific antigen MAGE BAGE GAGE and enlarge the application of immunotherapy on ovarian cancer.

　　Key words:demethylation;5aza2′deoxycytidine;ovarian tumor;tumor specific antigen;gene

　　MAGE、BAGE、GAGE家族基因表达产物是重要的肿瘤特异性抗原，其在不同组织类型的肿瘤中均有较高的阳性表达率，因此在肿瘤免疫治疗的研究中备受关注[1]。MAGE、BAGE、GAGE基因是一种正常的基因，它的表达受甲基化的调控,如细胞内基因不稳定会诱导脱甲基，导致该组基因在肿瘤细胞中的表达增加。5-杂氮脱氧胞嘧啶(DAC)为一脱甲基制剂,如将其与癌细胞一起孵育，可使癌细胞的基因表达率增高，从而扩大特异性免疫治疗的范围[2]。本研究主要分析了在DAC作用于卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1前后细胞生长及MAGE、BAGE、GAGE基因表达情况的改变。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞培养

　　卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1均在国内建立的细胞株。SKOV3、COC1、正常卵巢上皮细胞(normal ovarian epithelial cells，NOEC) 由山东大学齐鲁医院生物工程中心提供。作为阳性对照的黑色素瘤MEL526 细胞系由 Dr.Takesako 惠赠。细胞系培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，所有细胞均在37℃、5%CO2和一定湿度的条件下孵育培养，当细胞在培养瓶中生长到约80%时，常规消化收集，置-80℃冰箱保存。

　　1.2 细胞的DAC处理

　　参照文献报道[2]，DAC(美国Sigma化学公司)用冰醋酸∶水(1∶1)稀释成50 mg/mL的贮存液，过滤除菌。细胞以1×106个接种到培养瓶，贴壁后更换培养液并加入DAC，使其浓度达到1 μmol/L，每24 h换液并加DAC，连续培养，直到细胞生长到瓶底的80%(悬浮细胞株COC1生长到80%左右)，消化收集细胞，冻存于-80℃冰箱。

　　1.3 细胞周期的检测

　　将细胞在装有RPMI 1640培养基的6孔板中无血清培养36 h，加入终浓度为10%的小牛血清继续培养24 h。细胞浓度调整为2.5×106/mL，在实验孔内加入终浓度为200 nmol/L的DAC继续培养24 h。台盼篮(美国Sigma化学公司)拒染法计数生长指数曲线，同时每24 h进行细胞周期测定。取不同培养阶段的细胞悬液加入75%乙醇在-20℃中固定48 h，50 mg/L碘化丙锭(PI)(美国Sigma化学公司)染色5min，用流式细胞仪分析DNA含量，采用其自带的Multicycle软件分析G0、G1、G2、S期细胞比例，进行细胞周期的测定。

　　1.4 MAGE1、MAGE3、GAGE1/2及BAGE基因mRNA表达水平的测定

　　Trizol(上海生物工程有限公司产品)抽提各个细胞株总RNA。所提取RNA用紫外分光度计测得A260和A280，取4 μg RNA用逆转录酶MMLV和 oligodT引物(上海生物工程有限公司产品)合成第一链cDAN。PCR引物设计在不同的外显子上，以保证扩增的特异性，避免基因组DNA污染的影响。PCR扩增程序：MAGE1、βactin：94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环;MAGE3：94℃变性1 min，66℃退火1 min 15 s，72℃延伸1 min,共40个循环;GAGE1,2：94℃变性1 min，56℃退火2 min，72℃延伸3 min，共30个循环;BAGE：94℃变性1 min，60℃退火2 min，72℃延伸2 min，共30个循环;所有PCR扩增均需预变性5 min，反应末于72℃延伸6 min。扩增结束后进行1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色后，紫外灯下观察结果。捷达801专业凝胶图像采集与分析系统(3.3 版)采集分析图片。以黑色素瘤 MEL526 细胞系为阳性对照，以不加MMLV逆转录酶为阴性对照，以βactin为体系内控制。根据各肿瘤特异性抗原基因在GenBank中的序列，MAGE1、MAGE3、GAGE1/2及BAGE基因理想的PCR扩增长度分别为485、724、243、284 bp。见表1。表1 MAGE、GAGE、BAGE基因PCR扩增序列(略)

　　1.5 统计学方法

　　活细胞计数值的处理应用SPSS10.0统计软件，用重复测量方差分析进行分析。

　　2 结果

　　2.1 细胞生长情况

　　DAC能够抑制SKOV3、A2780、COC1细胞的生长，随着培养时间的延长，应用DAC组细胞的生长明显出现抑制，以72 h最为显著。未用DAC组的细胞生长正常(图1)。经重复观察分析，两组之间有显著差异(P<0.05)。倒置显微镜下可见试验组部分细胞体积变小、细胞皱缩，细胞内出现颗粒沉着;与对照组相比，细胞数明显降低，部分细胞失去正常形态。

　　2.2 细胞周期检测

　　应用DAC后SKOV3、A2780、COC1细胞停滞在G0期(表2)。表2 培养72 h后DAC对卵巢癌细胞系细胞周期的影响(%)(略)

　　2.3 卵巢癌细胞株在DAC作用前后肿瘤特异性抗原的表达

　　肿瘤特异性抗原基因MAGE、BAGE、在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1中的表达谱不尽相同。除SKOV3表达一种基因外，其他两种细胞株至少有两种基因表达。经DAC作用后，MAGE、BAGE、GAGE基因在细胞株中的阳性表达率明显升高(表3，图2)。表3 卵巢癌细胞株在DAC作用前后的基因表达(略)每种细胞株均进行3次重复试验，经统计学分析,应用DAC处理前后各细胞基因组RD差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨论

　　MAGE、BAGE、GAGE基因在不同恶性肿瘤的转录表达及其生物学性状已有广泛的研究。该类基因表达产生的抗原可以被自身免疫细胞识别，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫，故MAGE、BAGE、GAGE及其产物可用于肿瘤的分子学诊断和免疫治疗。对MAGE、BAGE、GAGE作为肿瘤细胞分子标志以及肿瘤免疫治疗特异性靶位的研究，已成为目前研究肿瘤免疫治疗的一个热点[3]。近来研究发现：许多恶性肿瘤的MAGE、BAGE、GAGE家族阳性表达率不高，从而限制了肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE家族在恶性肿瘤免疫学治疗中的应用。人们发现将DAC作用于黑色素瘤细胞系，可促进处于静止状态的MAGE1基因的表达。国内多篇文章报道DAC作用于大肠癌、乳腺癌、支气管癌细胞系，可有效诱导MAGE抗原在细胞内的表达，诱导出特异性的CTL。因此，DAC有可能作为肿瘤免疫治疗的一个有效方法[3-5]。

　　本研究中我们对DAC作用下3种卵巢癌细胞株增殖和肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE表达的影响进行了研究。为保证细胞处于对数生长期，首先将细胞无血清培养了36 h，然后加入胎牛血清继续培养24 h，再将细胞分组进行实验。如此可保证实验组细胞和对照组的大多数细胞处于对数生长期，并能使实验组与对照组细胞周期一致。进行基因表达分析之前，绘制生长指数曲线，并对细胞的周期变化进行了动态监测，保证检测的基因表达与细胞增殖完全统一。从生长指数曲线及细胞周期检测结果看，实验组细胞均处于对数生长期，在加入DAC作用24 h后细胞的生长受到抑制，处于G0期的细胞数多于对照组;48 h后，细胞数开始下降，以72 h最为显著，大多数细胞处于G0期。DAC对卵巢癌细胞的生长具有抑制作用，其可能机制是使细胞停滞在G0期，这与文献报道相一致[2]。基因表达结果表明，3种卵巢癌细胞株经过DAC去甲基化处理，RTPCR检测发现SKOV3的GAGE1/2基因、A2780的BAGE基因、COC1的BAGE基因的表达由去甲基化前的阴性转为阳性，其他基因在甲基化前后表达状况不变。

　　DAC作为一种甲基转移酶制剂，对甲基组CpG岛的高甲基化具有去甲基作用，从而使因高甲基化失活的基因表达。目前关于DAC诱导肿瘤特异性抗原表达增高机制的研究中，以MAGE基因研究的最为清楚。在多种恶性肿瘤中应用DAC的研究表明去甲基化能在多种肿瘤和正常细胞中诱发出MAGE基因的表达，推测肿瘤发生过程中存在去甲基化因子的参与。另有研究发现位于启动子的两个胞嘧啶和多个鸟嘌呤(CpG)位点与MAGE表达和去甲基化的关系十分密切，分析MAGE基因上游所有CpG位点，发现去甲基化过程可以导致基因的转录。当CpG位点进行甲基化作用后，MAGE的表达即被抑制[6]。DNA甲基化在基因表达调控、DNA修复、基因稳定及基因抑制方面起着重要作用。目前去甲基化治疗已成为一种诱导分化和抑制增殖的新方法，对AML、MDS、CML疗效肯定，其完全缓解率可达17%～20%[7]。另外，DAC在支气管癌、间皮瘤和肾细胞瘤的免疫治疗中有潜在的应用前景[3-5]。

　　通过基因疫苗或树突状细胞等策略，诱导机体产生对该肿瘤的特异性免疫应答，清除肿瘤或抑制其生长，可作为手术等常规治疗后的辅助治疗手段。目前关于MAGE、BAGE、GAGE在卵巢癌疫苗应用研究中较为普遍的是肽疫苗和 DC疫苗[8]。但某些类型的卵巢肿瘤MAGE、BAGE、GAGE家族的某些成员的阳性表达率不高，从而限制了肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE家族在该类恶性肿瘤免疫学治疗中的应用。DAC可促进卵巢癌细胞MAGE、BAGE、GAGE基因表达率增高,从而有望扩大特异性免疫治疗的范围。本研究提示DAC可以提高卵巢癌细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE表达的阳性率，且能抑制卵巢癌细胞的增殖，使大部分细胞停滞在G0期，对卵巢癌细胞的生长具有抑制作用。目前DAC在卵巢癌免疫治疗中的研究仅处于体外阶段，其疗效评价尚需要通过动物实验及大规模的临床试验加以证实。

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