增殖细胞核抗原和细胞周期依赖性激酶抑制剂p21WAF1/CIP1蛋白在大鼠肾上腺细胞体外原代培养中的表达及其意义

　　【摘要】 目的：探讨增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期依赖性激酶抑制剂p21WAF1/CIP1蛋白在大鼠肾上腺细胞体外原代培养中的表达及其意义。方法：用SP免疫组化法检测大鼠肾上腺细胞培养第3、5、7、9、11d的PCNA和p21蛋白表达强度。结果：在肾上腺细胞体外培养中，第3d((18±3)%)、5d((38±5)%)、7d((70±65)%)PCNA蛋白表达逐渐增强，第9((50±3)%)、11d((39±2)%)与第7d比减弱(P<0.05)。第3d((43±5)%)、5d((35±2)%)、7d((21±3)%)p21WAF1/CIP1蛋白表达逐渐减弱，第9d((39±3)%)、11d((52±4)%)与第7d比重新增强(P<0.05)。结论：肾上腺细胞体外原代培养在第7d　PCNA蛋白表达最强，p21WAF1/CIP1蛋白表达最弱，肾上腺细胞增殖也最旺盛。

　　【关键词】 增殖细胞核抗原;p21WAF1/CIP1蛋白;肾上腺;细胞培养;Wistar大鼠

　　Expression and Significance of Proliferating Cell Nuclear Antigen and

　　p21WAF1/CIP1 in Rats Adrenocortical Cell Culture in vitroHE Shang_jin1，ZHANG Xiao_bin2，ZHANG Jie2，JIN Hua_min2

　　(1 Department of Urology，The First Affiliated Hospital，Shantou University Medical College，Shantou 515041，China， 2 Department of Urology，Peoples Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China)[Abstract]Objective： To explore expression and significance of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and cyclin dependent kinase inhibitor p21WAF1/CIP1 in rats adrenocortical cell culture in vitro. Methods： Immunohistochemical method was adopted to examine the expressions of PCNA and p21WAF1/CIP1 in cell culture at d3、d5、d7、d9 and d11. Results： In adrenocortical cell culture in vitro， the expression of PCNA was gradually enhanced at d3((18±3)%)， d5((38±5)%)and d7((70±65)%)， but were gradually decreased at d9((50±3)%)and d11((39±2)%)(P<0.05)， and the expression of p21WAF1/CIP1 was decreased at d3((43±5)%)， d5((35±2)%)and 7d((21±3)%)， but were gradually enhanced at d9((39±3)%)or d11((52±4)%)(P<0.05). Conclusion： The proliferation of adrenocortical cells is the most vigorous in vitro at d7.

　　[Key Words]proliferating cell nuclear antigen，p21WAF1/CIP1，adrenal gland，cell culture，rat

　　虽然肾上腺皮质细胞移植取得了长足进步，但如何选择最佳移植时间并使移植细胞较快恢复功能及长期保持其功能呢增殖细胞核抗原(PCNA)与DNA复制和细胞增殖密切相关，是DNA聚合酶δ的相关因子，其表达程度可反映细胞增殖活性。p21WAF1/CIP1蛋白是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDI)，通过调控细胞周期的进程，参与细胞生长、分化、衰老及死亡。通过研究PCNA和p21蛋白在大鼠肾上腺细胞培养过程中不同时间的表达，进一步探讨大鼠肾上腺细胞体外培养时的生长特征，为肾上腺细胞移植治疗肾上腺皮质功能减退症提供理论依据，并找出最佳细胞移植时间。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物和主要试剂

　　Wistar大鼠(武汉大学医学院实验动物中心提供)50只，2周龄。胶原酶Ⅰ型，DNA酶Ⅰ型，DMEM/F_12培养基，胎牛血清(Sigma公司，美国);兔抗鼠PCNA单克隆抗体，兔抗鼠p21单克隆抗体，SP试剂盒，四盐酸3，3_二氨基联苯胺(DAB)(武汉博士德生物技术有限公司，中国);皮质酮放免法试剂盒(中国原子能研究院同位素研究所，中国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠肾上腺细胞取材 大鼠用质量分数10%的5_乙基_5_(1_甲基丁基)_2，4，6(1H，3H，5H)_噻啶三酮_钠盐(戊巴比妥钠溶液，质量浓度30mg/kg)腹腔麻醉，腹部皮肤用体积分数1%的碘伏和体积分数75%的酒精消毒后，“+”切开腹部皮肤和各层肌肉，暴露双侧肾脏;结扎肾上腺动、静脉，迅速取下双侧肾上腺后立即置于4℃无钙镁的D_Hanks液中洗涤3次。

　　1.2.2 大鼠肾上腺细胞原代培养 无菌罩内仔细剔除肾上腺周围脂肪，并切成约1mm×1mm×1mm碎块，置于质量浓度1g/L　Ⅰ型胶原酶、质量浓度5mg/L　DNA酶的消化液中37℃水浴振荡消化20min，待溶液呈粘糊状时加入适量含小牛血清的培养基终止消化反应，400目钢丝网过滤，收集滤液200g离心10min，弃上清液，D_Hanks液、DMEM/F_12培养基依次各洗涤2次，200g离心10min收集细胞，于DMEM/F_12培养基中重悬，反复吹打使细胞均匀分散呈单细胞悬液，按2～3×105/L个细胞分别接种于培养瓶(容积25mL)和12孔培养板中，然后将培养瓶放于37℃、体积分数95%的O2、体积分数5%的CO2温箱内原代培养。细胞接种后2d，贴壁细胞部分已融合生长，培养基的pH变酸，立即更换新培养基，去掉没有贴壁的细胞及破碎细胞。

　　1.2.3 皮质酮放射免疫法测定 于接种细胞后第3、5、7、9、11d分别吸取12孔培养板的培养液各1mL，置于Eppendorf管内，-20℃低温保存。将标本解冻后用放射免疫法测培养液中皮质酮质量浓度(武汉大学人民医院核医学科测定)。

　　1.2.4 免疫组化检测PCNA和p21蛋白的表达强度 取12孔培养板，吸除培养基，加入体积分数4%的多聚甲醛固定40min;除去多聚甲醛，用PBS轻洗细胞5min×3次，加入体积分数3%的H2O2中止内源性过氧化物酶活性，室温10min;滴加正常山羊血清封闭液静置20min，去除多余液体;用PBS轻洗细胞5min×3次，分别滴加单克隆一抗(兔抗鼠PCNA和p21单克隆抗体，工作抗体滴度1∶50)，室温下孵育3h;PBS冲洗5min×3次。滴加生物素标记的二抗(抗体稀释液稀释)，37℃孵育30min，PBS冲洗5min×3次;滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素(PBS稀释)，37℃孵育30min，PBS冲洗5min×3次;DAB显色;自来水充分冲洗，苏木精对比染色1min，酒精逐级脱水，过二甲苯透明，吹干，中性树脂胶封片;光镜下观察并摄片。以PBS代替特异性单克隆抗体设立阴性对照。

　　1.2.5 结果判断 细胞核呈棕黄色为阳性细胞。

　　1.2.6 图像分析 本实验采用北京航空航天大学设计的多功能真彩色病理图像分析系统(CMIAS系列)分析染色的阳性细胞个数。以平均光密度值来表示细胞染色的阳性率。同一培养孔下，选取4个不同部位采集标本，计算每一部位的平均光密度值，取其平均值。

　　1.3 统计学处理

　　统计结果以±s表示。数据输入SPSS11.5软件包进行统计分析。组间差异用t检验。

　　2 结果

　　2.1 PCNA和p21蛋白表达强度

　　肾上腺细胞体外培养第3d，细胞铺满培养板，PCNA和p21蛋白阳性表达率分别为20%、40%，第7d 68%、20%，第9d 53%、38%、11d 38%、50%(表1，图1～6，封4)。肾上腺细胞体外培养第3、5和7d，培养液中的皮质酮质量浓度逐渐上升，第7d达最高峰，第9、11d下降，且细胞的不同生长时间皮质酮质量浓度有统计学意义(P<0.05)。表1 不同生长时间肾上腺细胞PCNA和p21蛋白表达强度(±s)与皮质酮质量浓度

　　3 讨论

　　PCNA是参与DNA合成的蛋白质，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，能大量促进DNA聚合酶δ的合成活性，它也是分子质量为36000的酸性核蛋白。PCNA作为一种调节蛋白，其表达强度随细胞周期而变，在G1早期开始上升，S期达高峰，G2和M期持续下降，G0期维持极低水平。研究发现，在细胞分裂周期中，PCNA最能反映细胞的增殖活性，是判断细胞增殖状况的最好生物学指标之一[1]。p21WAF1/CIP1是第一个被发现的CDI家族成员，根据其发现途径的不同，又称CIP1，WAF1，CAP20，mda_6，SDI1，位于6p21.2，DNA长85kb，3个外显子，cDNA长2.1kb，编码164个氨基酸，N端第21～26个氨基酸与CyclinD/E结合，C端124～164个氨基酸与PCNA结合，中间第4972个已发现可与CDK2结合。p21蛋白适量表达与细胞正常生长、增殖和分化有关，但如果p21蛋白过表达，则使细胞进行无休止分裂和增殖，最终导致细胞癌变。

　　本研究通过观察肾上腺细胞体外培养不同时间PCNA的表达，发现在第7d，PCNA阳性表达率明显高于第3、5d，也高于之后的第9、11d(P<0.05)，提示在肾上腺细胞体外培养第7d，其增殖能力受PCNA影响最强。王春明等[2]在研究人类皮肤肉芽组织中PCNA表达后认为，DNA聚合酶δ辅酶和复制因子C一起识别引物_模板结合物，以帮助DNA聚合酶δ定位，同时，PCNA还加强聚合酶在延伸过程中的推进，可作为增殖的可靠指标。张刚等[3]发现PCNA存在于瘢痕组织的增殖细胞核内而静止期细胞缺乏，故PCNA免疫组化染色可作为估计细胞增殖活性的指标。吴承堂等[4]发现在严重腹腔感染时肠上皮细胞PCNA表达增强，同时认为PCNA表达与严重感染时肠黏膜损伤修复相关;因此，PCNA可很好反映细胞动力学变化，代表细胞增殖的潜能。实验结果显示在第7d时，PCNA表达最强，肾上腺细胞在第7d时增殖最旺盛，为寻找肾上腺细胞移植的最佳时间点提供了依据。本研究同时还观察肾上腺细胞体外培养不同时间p21蛋白的表达，发现在第7d，p21蛋白阳性表达率明显低于第3、5d，也低于之后的第9、11d(P<0.05)，提示在肾上腺细胞体外培养第7d，肾上腺细胞增殖能力受p21影响最弱。因为p21蛋白是一个双重特异性的抑制因子，有2个功能不同的结构域，既可通过N端与CDKs结合，不能进入S期，又可通过C端以1∶1或2.3∶1与PCNA结合，阻断进行性DNA复制[5]。因此，在其表达强度最弱的时候，细胞增殖受到其抑制作用也越小。有学者提出，p21调节细胞周期的机制可能与细胞凋亡密切相关。MATSUSHITA等[6]用凝血病毒介导p21基因转染到人主动脉平滑肌细胞上，发现p21蛋白表达明显增加，且细胞表现出典型的凋亡特征，因而认为p21诱导了一种凋亡启动蛋白，从而加速平滑肌细胞的凋亡。虽然p21基因可能并不直接诱导凋亡，但它可通过调控细胞周期与其它凋亡诱导因子共同作用完成。研究表明，tTG可通过蛋白质的谷氨酰胺残基与赖氨酸残基发生交联而形成凋亡小体，防止细胞成分在被吞噬细胞吞噬前外渗引起炎症或免疫反应[7]。p21蛋白是否诱导了体外培养的肾上腺细胞凋亡，还有待进一步研究。

　　肾上腺作为一个实质性器官，在机体内主要作用是分泌糖皮质激素和盐皮质激素，本实验测定培养液中的皮质酮质量浓度，发现在第7d时，肾上腺细胞分泌糖皮质激素的功能最强，培养液中的糖皮质激素质量浓度达最高峰。与PCNA蛋白在肾上腺细胞的表达强度对照发现，此时肾上腺增殖旺盛，受PCNA影响最强。

　　因此，PCNA和p21蛋白表达强度的对比观察有助于我们评价体外培养肾上腺细胞的增殖过程，并且与肾上腺细胞分泌皮质酮的功能进行对比研究，为寻找到肾上腺细胞最佳移植时限提供实验依据，在其生长最旺盛、分泌功能最强的时间进行移植，可更好地发挥细胞移植的功能替代作用。但其移植存活还受到诸多因素的影响(移植排斥反应，缺乏调节肾上腺细胞增殖分化的调控因子，移植细胞血管化程度不足等)。

　　【参考文献】

　　[1]MATUNIS M J. On the road to repair: PCNA encounters SUMO and ubiquitin modifications[J]. Mol Cell, 2002, 10(3): 441-442.

　　[2]王春明, 尹丽书, 姜永前. 皮肤肉芽组织中VEGF、PCNA和ED1表达的变化[J]. 基础医学与临床, 2004, 24(1): 34-36.

　　[3]张刚, 罗少军, 汤少明, 等. 瘢痕疙瘩不同部位PCNA的表达及其意义[J]. 中国医师杂志, 2005, 7(3): 292-293.

　　[4]吴承堂, 郑永波. 严重腹腔感染时肠上皮细胞PCNA表达及其意义[J]. 中国危重病急救医学, 2004, 16(12): 738-739.

　　[5]BOULAIRE J, FOTEDAR A, FOTEDAR R. The functions of the cdk_cyclin kinase inhibitor p21WAF1[J]. Pathol Biol, 2000, 48(3): 190-202.

　　[6]MATSUSHITA H, MORISHITA R, KIDA I, et al . Inhibition of growth of human vascular smooth muscle cells by overexpression of p21 gene through induction of apoptosis[J]. Hypertension, 1998, 31(1): 493-498.

　　[7]ASCHOFF A P, GüNTHER E, JIRIKOWSKI G F. Tissue transglutamnase in the small intestine of the mouse as a marker for apoptosis cells. Colocalization with DNA fragmentation[J]. Histochem Cell Biol, 2000, 113(4): 313-317.