17β_雌二醇对新生牛血清诱导的血管平滑肌细胞增殖反应的影响及其机制

　　【摘要】 目的：探讨雌甾_1,3,5(10)_三烯_3，17β_二醇(17β_雌二醇)对新生牛血清诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖反应的影响及其机制。方法：用新生牛血清刺激培养的VSMCs增殖，MTT法检测17β_雌二醇对新生牛血清诱导的VSMCs增殖的影响，并用Western blot检测caveolin_1蛋白，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及NO在此过程中的变化。结果：与对照组比，新生牛血清可促进VSMCs增殖(P<0.05)，17β_雌二醇作用24h后能明显抑制上述作用(P<0.05);17β_雌二醇预处理可抑制新生牛血清诱导的VSMCs中caveolin_1，iNOS蛋白表达下降及NO释放(P<0.05);17β_雌二醇受体阻断剂1_{4_[2_(n,n_二甲氨基)乙氧基]苯｝_1,2_二苯_1_丁烯(他莫昔芬)预处理可部分逆转17β_雌二醇的抑制作用(P<0.05)。结论：17β_雌二醇通过其受体可抑制新生牛血清诱导的VSMCs增殖，此过程与上调caveolin_1蛋白表达，激活iNOS，增加NO释放有关。

　　【关键词】 17β_雌二醇;caveolin_1;诱导型一氧化氮合酶;血管平滑肌细胞

　　Influence of 17β_estradiol on Vascular Smooth Muscle Cells Proliferation Induced

　　by Fetal Calf Serum and Its MechanismLIU Hai_mei1，ZHAO Xiao_feng2，XU Jin_wen3，LIN Gui_ping3，WANG Ting_huai3

　　(1 Department of Physiology，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China，2 Department of Physiology，Me_dical College of Shaoguan University，Shaoguan 512026，China，3 Department of Physiology，Zhongshan Medical College，Sun_Yat Sen University，Guangzhou 510080，China)

　　[Abstract]Objective： To investigate the influence of 17β_estradiol on vascular smooth muscle cells(VSMCs)proliferation induced by fetal calf serum and the related mechanism. Methods： The fetal calf serum was used to stimulate cultured VSMCs proliferation(P<0.05)，and the effects of estrogen on VSMCs proliferation were determined by MTT，and the expressions of caveolin_1 and inducible nitric oxide synthase(iNOS)were also detected by Western blot. Results： Compared with the normal control group， the fetal calf serum could increase the VSMCs proliferation(P<0.05)， and inhibit proliferation effect of fetal calf serum，pretreated with estradiol for 24 hours(P<0.05). Western bolt results further proved that 17β_estradiol inhibited the downregulation of caveolin_1， iNOS and NO induced by fetal calf serum， which was prevented by pretreatment with estrogen antagonist， Tamoxifen(P<0.05). Conclusion： 17β_estradiol can inhibit VSMCs proliferation induced by fetal calf serum， and this effect is mediated by estrogen receptor. 17β_estradiol increases caveolin_1 and iNOS protein expression， and NO release，leading to the inhibition of VSMCs proliferation induced by fetal calf serum.

　　[Key Words]17β_estradiol，caveolin_1，inducible nitric oxide synthase，vascular smooth muscle cell

　　血管损伤后，刺激因子诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)的过度增殖和迁移是再狭窄发生的关键[1_2]，临床及流行病学资料显示，雌甾_1,3,5(10)_三烯_3，17β_二醇(17β_雌二醇)具有心血管保护作用，我室前期的实验研究也证实这点[3]，在离体培养的VSMCs中17β_雌二醇可抑制ET_1诱导的VSMCs增殖，此过程与抑制细胞外信号通路1/2(ERK1/2)有关。17β_雌二醇的血管保护作用与诱导NO生成有关，但在VSMCs中，17β_雌二醇通过何种途径诱导NO合成，目前尚未明了。因此，本研究利用离体培养的兔胸主动脉VSMCs，观察caveolin_1及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在17β_雌二醇诱导NO合成及抑制VSMCs增殖中的作用和机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂雌性新西兰大白兔(购自中山大学实验动物中心)7只，体质量2.5～2.7kg。DMEM培养基、新生牛血清、小牛血清(Gibco公司，美国)、17β_雌二醇、胰蛋白酶、1_{4_[2_(n，n_二甲氨基)乙氧基]苯｝_1，2_二苯_1_丁烯(他莫昔芬)、L_硝基_左旋精氨酸甲酯(左旋_硝基精氨酸甲酯，L_NAME)、亮肽素、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、三羟甲基氨基甲烷、考马思亮兰(Sigma公司，美国);兔抗iNOS多克隆抗体(Abcam公司，中国)，兔抗caveolin_1多克隆抗体(Fharmingen公司，美国)，NO测定试剂盒(精美生物工程有限公司，中国)，其它试剂为国产分析纯。

　　1.2 VSMCs培养

　　利用组织块贴壁法培养兔胸主动脉VSMCs。待细胞长满瓶底后加入质量分数2%的胰蛋白酶消化传代。用4～6代细胞进行实验。实验用VSMCs选用SABC免疫组化法α_actin抗体进行鉴定。

　　1.3 MTT比色法检测活细胞数量

　　将VSMC接种于96孔板上，用无酚红无血清DMEM培养液培养24h。在新生牛血清促增殖实验中，加入体积分数10%的新生牛血清继续培养24h。在17β_雌二醇抑制增殖实验中，加入不同浓度17β_雌二醇提前孵育24h后，再加入10%新生牛血清继续培养。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)37℃孵育4h后，倾倒培养液，加入二甲基亚砜终止反应，酶标仪于570nm处测量吸光度。在17β_雌二醇孵育细胞之前，加入他莫昔芬(10_7mol/L)，或iNOS阻断剂L_NAME(10_6mol/L)，或caveolin_1蛋白阻断剂β_MCD(10_3mol/L)提前孵育2h。

　　1.4 免疫印迹法检测蛋白表达

　　培养细胞于6孔培养板中经过不同药物处理后，加入0.1mL蛋白提取液裂解细胞，收集提取液，离心后取上清液Bradford法测定蛋白质质量浓度，并进行SDS_PAGE电泳，电印迹转移至硝酸纤维素膜上，分别与一抗(兔抗iNOS多克隆抗体(稀释度1∶50)，兔抗caveolin_1多克隆抗体(稀释度1∶100))和二抗孵育，与ECL试剂反应1min后，X光胶片压片曝光，用IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度，并进行积分处理，以对照组为100%进行统计分析作图。

　　1.5 VSMCs中NO浓度测定

　　采用NO测定试剂盒，比色法测定。VSMCs经影响因子处理后，取细胞培养上清液100μL，加入磷酸盐缓冲液和硝酸还原酶，37℃孵育1h，加入显色剂后530nm波长测定吸光度。NO(μmol/L)=测定管OD/标准管OD×100μmol/L。

　　1.6 统计学处理

　　数据以±s表示。用SPSS11.0统计软件，以单因素方差分析，组间比用t检验。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度17β_雌二醇对10%新生牛血清诱导的VSMCs活性增加的影响MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，实验中活细胞数量多少可反映细胞增殖情况。从图1可以看出，10%新生牛血清处理VSMCs 24h后，细胞活性比正常对照组的明显增加(n=6，P<0.05)。提前用10_5～10_10 mol/L的17β_雌二醇预处理VSMCs　24h，均可抑制10%新生牛血清诱导的VSMCs增殖，其作用以10_8mol/L　17β_雌二醇最明显(n=6，P<0.05)。

　　与正常对照组比 *P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.052.2 不同阻断剂对17β_雌二醇抑制VSMCs活性增加的影响提前用17β_雌二醇受体阻断剂他莫昔芬(10_7mol/L)孵育细胞2h，结果显示，他莫昔芬预处理可部分逆转17β_雌二醇对VSMCs增殖的抑制(n=6，P<0.05，图2)。β_MCD提前孵育2h，与17β_雌二醇孵育组比，10_5mol/L　β_MCD可部分阻断17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6，P<0.05)。为探讨iNOS在17β_雌二醇抑制VSMCs增殖中的作用，我们选用L_NAME提前孵育细胞，结果显示，L_NAME提前孵育后与17β_雌二醇孵育组比，细胞活性明显增高，提示，L_NAME可部分阻断17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6，P<0.05)。他莫昔芬、β_MCD或L_NAME单独孵育对VSMCs增殖无影响。

　　图2 他莫昔芬，β_MCD，L_NAME对17β_雌二醇抑制VS_MCs活性的影响(n=6。1正常对照组 210%新生牛血清组 310%新生牛血清+17β_雌二醇组 410%新生牛血清+17β_雌二醇+他莫昔芬组 5他莫昔芬组 610%新生牛血清+17β_雌二醇+β_MCD组 7β_MCD组 810%新生牛血清+17β_雌二醇+L_NAME组 9L_NAME组)

　　与正常对照组比 *P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.05;与17β_雌二醇+10%新生牛血清组比 ##P<0.052.3 17β_雌二醇抑制VSMCs增殖过程中caveolin_1蛋白表达情况10%新生牛血清作用24h可明显降低caveolin_1蛋白表达(n=3，P<0.05，图3、4)，提前用17β_雌二醇预处理细胞可显著增加caveolin_1蛋白表达(n=3，P<0.05)。为探讨17β_雌二醇增加caveolin_1蛋白表达抑制VSMCs增殖是否通过雌二醇受体，我们选用他莫昔芬提前孵育细胞2h，结果表明，他莫昔芬孵育组caveolin_1蛋白表达下降(n=3，P<0.05)，而他莫昔芬单独作用对VSMCs增殖无影响。图3 用Western blot检测17β_雌二醇及他莫昔芬对VSMCs中caveolin_1蛋白表达的结果(1正常对照组 210%新生牛血清组 310%新生牛血清+17β_雌二醇组 410%新生牛血清+17β_雌二醇+他莫昔芬组 5他莫昔芬组)

　　与正常对照组比 *P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.05;与10%新生牛血清+17β_雌二醇组比 ##P<0.052.4 17β_雌二醇抑制VSMCs增殖过程中iNOS蛋白表达情况10%新生牛血清作用24h可明显降低iNOS蛋白表达(n=3，P<0.05，图5、6)，若提前用17β_雌二醇预处理VSMCs，可显著增加iNOS蛋白表达(n=3，P<0.05)。且β_MCD提前孵育VSMCs可抑制17β_雌二醇诱导的iNOS蛋白表达增加。图5 β_MCD对VSMCs中iNOS蛋白表达Western blot结果(1正常对照组 210%新生牛血清+17β_雌二醇+β_MCD组 3β_MCD组 410%新生牛血清组 510%新生牛血清+17β_雌二醇组)

　　与正常对照组比 *P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.05;与10%新生牛血清+17β_雌二醇组比 ##P<0.052.5 17β_雌二醇对VSMCs中NO合成的影响与正常对照组比，10%新生牛血清孵育后，VSMCs中NO表达下降(n=6，P<0.05，图7)，而用17β_雌二醇提前孵育细胞可明显增加NO浓度(n=6，P<0.05)。加入L_NAME或β_MCD后，可抑制17β_雌二醇诱导的NO合成增加(n=6，P<0.05)。

　　3 讨论

　　VSMCs过度增殖和迁移以及由此引起的细胞外基质的大量合成是导致动脉粥样硬化、高血压和经皮冠状动脉内成形术术后管腔再狭窄的关键环节[1_2]。研究表明，位于VSMCs膜上caveolae结构是介导细胞内信号转导的中心，而其标志性蛋白caveolin_1可通过其脚手架结构与多种信号蛋白相连接，起着调节细胞信号转导的开关作用。VSMCs过度增殖与迁移是促进动脉粥样斑块形成的主要因素。LIN等[4]选用高脂饮食诱导动脉粥样硬化模型，结果显示：高脂饮食第5周血管内膜中caveolin_1表达达到最高峰，此后开始下降，并于动脉粥样斑块形成的第8周，其表达下降至最低;而VSMCs增殖则在第5周开始逐渐增强，并于8～12周其增殖能力最强，提示caveolin_1表达与VSMCs增殖及动脉粥样斑块形成之间存在密切关联。内皮素受体属于G蛋白偶联受体中的一员，定位于caveolae中，与caveolin_1相连，内皮素_1与其受体结合后，通过增加caveolin_1蛋白表达，增强钙通道开放，增加细胞内Ca2+浓度[5_6]，抑制VSMCs增殖。血管紧张素Ⅱ是诱导VMSCs增殖的重要刺激因子，它可以通过与其受体结合，通过调节caveolin_1，促进活性氧依赖的表皮生长因子受体转录及增加Akt活性，诱导VSMCs增殖[7]。我们的实验结果也表明，新生牛血清可通过抑制caveolin_1蛋白表达，促进VSMCs增殖;而17β_雌二醇预处理可通过增加caveolin_1表达，抑制新生牛血清诱导的VSMCs增殖。

　　NO是一种内皮依赖性松弛因子，具有极强的舒张血管效应，同时还可抑制血小板聚集和血栓形成。一氧化氮合酶是NO合成的关键酶，VSMCs中主要表达iNOS。白藜芦醇是红酒中参与血管保护的重要因子，它可通过增加iNOS活性，促进NO合成与释放，抑制VSMCs增殖。研究发现，17β_雌二醇受体阻断剂ICI　182，780提前孵育可逆转此效应，提示白藜芦醇是通过与雌二醇受体结合，发挥其抑制VSMCs增殖的效应[8]。RODRGUEZ等[9]研究表明，瘦素可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的VSMCs增殖，在此过程中，磷酸化信号转导因子和转录活化因子(STAT3)及Akt蛋白表达增加，iNOS活性及NO合成增加，若用Janus激酶(JAK2)阻断剂AG490或磷脂酰肌醇(_3)激酶(PI3K)阻断剂wortmannin可显著抑制瘦素诱导的iNOS活性增加，提示，瘦素可通过激活JAK2/STAT3及PI3K/Akt信号途径，增加iNOS活性，促进NO合成，抑制血管紧张素Ⅱ诱导的VSMCs增殖。我们的研究结果同样显示，17β_雌二醇可通过增加iNOS活性及蛋白表达，促进NO合成，抑制新生牛血清诱导的VSMCs增殖。为进一步探讨17β_雌二醇抑制VSMCs增殖过程中，caveolin_1表达增加与iNOS之间的关系，我们选用β_MCD预处理，抑制caveolin_1表达，结果显示iNOS蛋白表达下降，NO合成减少。

　　综上所述，我们的研究结果证实了17β_雌二醇可通过促进iNOS蛋白表达，增加NO合成，抑制VSMCs增殖;在新生牛血清促进VSMCs增殖过程中，caveolin_1蛋白表达降低，17β_雌二醇提前孵育可增加caveolin_1表达;且17β_雌二醇可通过上调caveolin_1蛋白表达，增加iNOS表达及NO合成，抑制VSMCs增殖。此研究结果有助于进一步明确17β_雌二醇抑制VSMCs增殖过程中caveolin_1的作用机制，加深17β_雌二醇对心血管保护作用机制的阐明。

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