不同方法鉴定差异显示技术RAP_PCR得到差异基因的比较

　　【摘要】 目的：评价用RAP_PCR法从测序胶上得到深海细菌(Shewanella piezotolerance WP3)差异片段验证的最佳方法。方法：用RT_PCR，RNA点杂交，荧光实时定量PCR对不同盐浓度的差异片段进行对比实验。结果：3种方法均能检测到片段的差异表达：RT_PCR灵敏性最强，RNA点杂交需要的RNA量最大，荧光实时定量PCR精确性最高。结论：在实验条件允许下，用荧光实时定量PCR对较少片段的验证较好。

　　【关键词】 Shewanella　piezotolerance　WP3;差异显示;RAP_PCR方法;差异片段，验证

　　Comparison of Three Methods for Confirmation of Differential Fragments from

　　RAP_PCRLI Sheng_kang1， 2，WANG Yu_qiao2

　　(1 Department of Biology，College of Science of Shantou University，Shantou 515063，China，2 Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources，Third Institute of Oceanography State Oceanic Administration，Xiamen 361005，China)

　　[Abstract]Objective： To test the best method for confirming differential fragments from the sequencing gels. Methods： RNA samples of the cultures from the different salt concentrations were taken as a model. RT_PCR， RNA dot hybridization and real_time PCR were used for confirmation of differential fragments. Results： Three methods could produce good results. RT_PCR method had high sensibility，RNA dot hybridization needed huge quantitative RNA sample and the real_time PCR had high accuracy. Conclusion： Real_time PCR which can quantify the change folds can be a better choice.

　　[Key Words]Shewanella piezotolerance WP3，differential display，RAP_PCR，differential fragment,confirmation

　　Shewanella　piezotolerance　WP3分离自西太平洋1914m的深海沉积物中，是一株革兰氏阴性、兼性厌氧的杆状深海细菌，耐冷、压，生长温度0～28℃，最适15℃，生长压力0～50MPa，最适20MPa，是研究极端微生物适应极端环境的理想材料[1]。作者选用WP3生长的2个极限生长盐浓度构建RNA池，以不同盐浓度的RNA，在WP3中建立差异显示RAP_PCR法[2]，但这种技术最突出的特点是得到的片段假阳性比率较高。对于大规模差异片段的筛选，已有文献报道的反向RNA点杂交方法[3]。但对于少量差异片段的筛选，用何种方法合适，目前少有报道。本研究用RAP_PCR法从测序胶上得到WP3的差异片段，旨在探讨重新验证这些片段的最佳方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 RNA提取、纯化及检测

　　WP3的培养选用海水培养基2216E(5g/L蛋白胨，1g/L酵母膏，0.1g/L磷酸铁，34g/L NaCL)。实验用差异显示引物见参考文献[4]，引物来自大肠杆菌基因组序列，其中反转录引物中含TTA，TCA等终止密码，而PCR引物中则含ATG起始密码，这样得到的每个产物都尽量包含起始和终止密码的开放阅读框。RNA提取按TRIzol方法进行(见MBI操作说明)，提取好的RNA样品要通过DNaseI(Takara公司，日本)处理以去掉残留的基因组DNA污染。

　　1.2 RAP_PCR建立及获得差异片段

　　RNA样品通过DNaseI处理去除基因组污染，然后用AMV反转录酶(Invitrogen公司，美国)42℃　90min反转录。通过RAP_PCR扩增后，用质量分数8%的聚丙烯酰胺凝胶(通过尿素变性)电泳，用Scientific电泳系统(CBS公司，美国)1200W恒压电泳4h后至二甲苯砸青并到达玻璃板底部。寻找差异条带，将其小心用无菌刀片切割回收后95℃　20min处理用作模板重新扩增，扩增得到的片段送至上海生工克隆测序。

　　1.3 差异片段的重新鉴定

　　选用RT_PCR，RNA点杂交，荧光实时定量PCR对有关差异条带进行重新验证。RT_PCR所用引物跟差异显示一样。RNA点杂交法：用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖纯化试剂盒纯化，纯化后一部分制备探针。准备好纯化的RNA，反转录合成cDNA，PCR检验cDNA质量合格后纯化，用地高辛标记(按试剂盒提供的方法检测标记效果)，取回收的电泳差异条带重扩增的PCR产物50ng，94℃变性5min，点样器将样品点到尼龙膜上，进行紫外交联，按25ng/mL取标记好的探针，在杂交炉杂交，随后进行免疫检测，检测所回收差异片段的真假。荧光实时定量PCR采用SYMBOL green I染料。所需引物经ABI软件引物设计软件[5]。

　　2 结果

　　第2期 李升康等.不同方法鉴定差异显示技术RAP_PCR得到差异基因的比较

　　2.1 RT_PCR验证中的看家基因

　　在做RT_PCR之前，需要找看家基因作为参比标准。通过RNA点杂交，发现pepN编码aminopeptidase N在不同盐浓度(质量分数1%、7%的NaCl 2216E海水培养基)和高盐浓度(质量分数20%的NaCl)刺激条件下为组成性表达(图1)。从后来的基因芯片杂交结果看，pepN在其他胁迫条件下的表达均无明显变化。因此，pepN可作为RT_PCR中的阳性对照。图1 pepN在不同胁迫条件下组成性表达

　　2.2 差异片段的重新验证

　　2.2.1 RT_PCR 为保证RT_PCR结果的可靠性，3次独立实验中提取的不同盐浓度RNA反转录作为模板。而对每个片段而言，又独立地作2次RT_PCR以保证结果的重现性。在随机选取的3个测序片段中，其中一个为假阳性。图2示以pepN为内对照，通过半定量RT_PCR发现其余2个为差异表达片段。图2 RT_PCR检测差异表达片段

　　2.2.2 RNA点杂交 以pepN为内对照，对Y1、Y2片段进行地高辛标记，与来自不同盐浓度生长菌体的RNA进行杂交，结果可见Y1和Y2在不同盐浓度中存在差异表达，其中Y1上调，Y2下调(图3)。图3 RNA点杂交验证差异表达片段

　　Fig.3 The detection of the differentially_expressed fragments by RNA dot hybridization

　　2.2.3 荧光实时定量PCR 首先优化了荧光实时定量PCR的扩增体系，分别检测Y1和Y2的扩增曲线和溶解曲线(图4、5)。通过荧光实时定量PCR实验表明，得到的差异表达片段是Y1表达上调3.598倍，Y2表达下调0.302(图6)。

　　3 讨论

　　生物体表现出的各种特性，主要是由基因的差异表达引起的，这种表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。在研究WP3在不同盐浓度，温度中的基因差异表达时，它的全基因组测序工作还正在进行之中，当时在对WP3基因组序列了解不多的情况下选用了原核生物特异的差异显示研究方法——RNA随机引物PCR(RAP_PCR)[6_7]。与文献报道一样[8]，本实验结果显示，测序胶电泳后出现差别条带太多，假阳性率高达70%左右，重复性差，且对高丰度的RNA具很强的倾向性。在有差异的显示片段中难以知道哪些基因是已知的，哪些是未知的。本次实验得到的有差异的扩增条带短(110～450bp)。如何有效的从备选的差异片段中进一步验证真正差异表达的基因是很重要的。作者分别用3种方法验证了从变性长胶聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的片段，结果表明，RT_PCR灵敏性最强，RNA点杂交需要的RNA量最大，荧光实时定量PCR精确性最高。因此，在实验条件允许下，用荧光实时定量PCR对较少片段的验证较好，此法需要的RNA样品少，基因差异表达的变化可以量化。

　　【参考文献】

　　[1]WANG F, WANG P, CHEN M, et al. Isolation of extremophiles with the detection and retrieval of Shewanella strains in deep sea sediments from the west Pacific[J]. Extremophiles, 2004, 8: 165-168.

　　[2]LIANG P, PARDEE A B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J]. Science, 1992, 257(5072): 967-971.

　　[3]LIANG P, AVERBOUKH L, PARDEE A B. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization[J]. Nucleic Acids Res, 1993, 21(14): 3269-3275.

　　[4]FISLAGE R, BERCEANU M, HUMBOLDT Y, et al. Primer design for a prokaryotic differential display RT_PCR[J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25: 1830-1835.

　　[5]MALHOTRA I, DENT A, MUNGAI P, et al. Real_time quantitative PCR for determining the burden of Plasmodium falciparum parasites during pregnancy and infancy[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(8): 3630-3635.

　　[6]BENSON N R, WONG R M, MCCLELLAND M. Analysis of the SOS response in Salmonella enterica serovar typhimurium using RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR[J]. J Bacteriol, 2002, 182: 3490-3497.

　　[7]BIDLE K A. Differential expression of genes influenced by changing salinity using RNA arbitrarily primed PCR in the archaeal halophile Haloferax volcanii[J]. Extremophles, 2003, 7: 1-7.

　　[8]NAGEL A, FLEMING J T, SAYLER G S. Reduction of false positives in prokaryotic mRNA differential display[J]. Biotechniques, 1999, 26: 641-643.