缺氧对逼尿肌细胞缝隙连接蛋白Cx43表达的影响

　　【摘要】 目的：探讨缺氧对膀胱逼尿肌细胞缝隙连接蛋白(Cx)43表达的影响。方法：体外培养膀胱逼尿肌细胞，用连二亚硫酸钠清除培养基内的氧，建立缺氧模型，通过RT_PCR、Western blot检测正常对照组、缺氧(A)组及VitE预处理(B)组的逼尿肌Cx43表达情况，并检测丙二醛质量浓度。结果：A、B组Cx43和Cx43mRNA相对表达及丙二醛质量浓度均较对照组明显升高(P<0.01)，A组表达最高，与B组比有统计学意义(P<0.05)。结论：缺氧可诱导逼尿肌细胞Cx43高表达，且与氧化损伤程度相关。

　　【关键词】 缝隙连接蛋白43;缺氧;不稳定膀胱;丙二醛

　　Influence of Hypoxia on Connexin43 in Detrusor Smooth Muscle CellXU Ya，ZHANG Zhen_bao

　　(Department of Urology，The Second Affiliated Hospital，Shantou University Medical College，Shantou 515041，China)

　　[Abstract]Objective： To investigate the influence of hypoxia on connexin(Cx)43 in detrusor smooth muscle cells. Methods： Hypoxia model of detrusor smooth muscle cell in vitro was established by sodium hyposulfite which consumed the oxygen of the medium. The Cx43 and Cx43 mRNA were detected by Western blot and RT_PCR. The level of malondialdehyde was detected. Results： The Cx43， Cx43 mRNA and the level of malondialdehyde of group A and B were much higher than those of control group(P<0.01)， and the expression of group A was higher than that of group B(P<0.05). Conclusion： Hypoxia can upregulate the expressions of Cx43 and Cx43 mRNA in detrusor smooth muscle cell，and it may be associated with the degree of oxidative damage.

　　[Key Words]connexin 43，hypoxia，overactive bladder，malondialdehyde

　　膀胱出口梗阻是导致不稳定膀胱的常见原因：顺应性下降，膀胱内压增加，膀胱壁张力大且逼尿肌细胞增生肥大，膀胱有效血流量下降，随着膀胱的贮尿及排尿形成反复的缺血再灌注现象。研究发现，血管阻塞性疾病及继发缺血缺氧可诱导不稳定膀胱形成[1～3]。不稳定膀胱逼尿肌细胞的缝隙连接较正常的明显增多，其通讯功能亦较正常的加强，具有低电阻通路特点的缝隙连接的增多亦被认为是传递逼尿肌细胞异常收缩的重要条件之一[4]。本实验拟通过建立逼尿肌细胞体外缺氧模型，旨在观察缺氧对逼尿肌细胞缝隙连接蛋白(Cx)43表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验细胞

　　膀胱逼尿肌细胞取自健康SD新生幼鼠(汕头大学医学院实验动物中心提供。180只，7～14d龄)膀胱，分离、培养并经平滑肌特异性抗体(SM_α_actin)证实是膀胱平滑肌细胞。

　　1.2 主要试剂

　　抗Cx43单克隆抗体、SM_α_actin(Santa Crutz公司，美国)，羊抗小鼠IgG_生物素标记试剂(武汉博士德生物工程有限公司，中国)。总RNA提取试剂盒、2×Tag PCR MasterMix试剂盒(Tiangen公司，美国)，丙二醛测定试剂盒(南京建成生物研究所第一分所，中国)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 SD幼鼠逼尿肌细胞培养及鉴定 分离并取出SD幼鼠膀胱[5]，用酶消化法和差速贴壁法分离、纯化其逼尿肌细胞，用含体积分数10%的热灭活胎牛血清的DMEN高糖培养基，在37℃，体积分数5%的CO2条件下常规培养，并经SM_α_actin证实为膀胱逼尿肌细胞，取对数生长期细胞进行实验。

　　1.3.2 分组 将培养细胞分成缺氧组(A组。弃原培养基，用PBS洗3次后加入含1mmol/L连二亚硫酸钠的DMEN低糖培养基，扭紧瓶盖后，置入37℃，5%　CO2培养箱中培养30min)，VitE预处理组(B组。弃原培养基，用PBS洗3次，用含VitE　100mg/L的DMEM高糖培养基预处理2h后行缺氧处理30min，方法同A组)和正常对照组(弃原培养基，用PBS洗3次后加入DMEN高糖培养基常规培养)。

　　1.3.3 丙二醛质量浓度测定 弃原培养基，用PBS洗3次后用细胞刮刮下逼尿肌细胞，置于超声波细胞粉碎机充分裂解细胞，制得组织匀浆。按丙二醛试剂盒说明书测定丙二醛质量浓度。

　　1.3.4 RT_PCR测定Cx43mRNA表达 取各组对数生长期细胞2瓶，按Tiangen总RNA提取试剂盒说明书提取各实验组总RNA。Cx43上游引物：5′_TT_CCTGCTCATCCAGTGGT_3′，下游：5′_TTCTTCCCTT_CACGCGAT_3′。用Tiangen2×Tag PCR MasterMix试剂盒说明书步骤加样，PCR循环设定：94℃×3min预变性，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，随后72℃延伸10min。PCR产物5μg于质量分数1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外光凝胶成像并测定光密度值，与相应内参照18s比较表示最终结果。

　　1.3.5 Western blot测定Cx43蛋白浓度 用2×SDS裂解液常规提取各组细胞总蛋白质。取各组细胞总蛋白各30μg进行SDS_PAGE电泳，电转移至硝酸纤维膜后用质量分数5%的脱脂奶粉_PBS室温封闭1h，加一抗：小鼠抗大鼠IgG Cx43单克隆抗体(1∶200)，4℃过夜，PBS充分洗涤3次后，加二抗：羊抗小鼠IgG_生物素标记(1∶1000)，室温孵育3h，4CN显色，适时终止，光密度扫描，the Quantity sofeware图像分析系统(Biorad公司，USA)分析显色条带。

　　1.4 统计学处理

　　实验数据用±s表示，用系统软件SPSS进行统计学处理，组间比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 丙二醛质量浓度

　　正常对照组丙二醛质量浓度为(0.89±0.12)nmol/mg，A组((1.40±0.14)nmol/mg)和B组((1.22±0.11)nmol/mg)丙二醛质量浓度与正常对照组比有统计学意义(P<0.01)。A、B组丙二醛质量浓度比也有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 RT_PCR测定Cx43 mRNA表达

　　RT_PCR结果显示，在43ku处均有阳性条带，A组(1.53±0.13)和B组(1.15±0.09)相对光密度值明显高于对照组(0.95±0.05)(P<0.01)，A、B组间相对光密度值比也有统计学意义(P<0.05)。图1 RT_PCR测定Cx43的mRNA表达

　　2.3 Western blot测定Cx43蛋白浓度

　　膀胱逼尿肌细胞经缺氧培养后，A、B组的Cx43表达均较正常对照组增多，缺氧30min后，A组Cx43表达最高，B组次之，两组均较正常对照组增多(P<0.05)，且A、B组间Cx43表达有统计学意义(P<0.05)。图2 Western blot测定Cx43蛋白浓度

　　3 讨论

　　引起不稳定膀胱中逼尿肌细胞Cx43表达增多的机制尚未明确。在心血管及神经细胞的研究中发现，缺血缺氧影响着多种Cx的表达，氧化损伤与心血管及神经细胞的Cx43表达变化密切相关。膀胱出口梗阻后会带来一系列病理生理(膀胱壁中小血管增生，血流重新分布，在早期可使膀胱内有效血流量增加)变化，但随着梗阻时间延长，膀胱组织重构，纤维增多，逼尿肌细胞肥大，膀胱内的有效血流量反而减少[6_7]。AZADZOI等[3]发现在前列腺增生伴不稳定膀胱者中，约70%的患者经尿道前列腺电切术解除膀胱出口梗阻后膀胱功能得以恢复，余30%术后不稳定膀胱仍然存在，而后者膀胱血管阻力较前者明显增高，膀胱有效血流灌注下降[3]，局部缺氧情况依然存在。缺血缺氧导致膀胱组织氧化损伤可能是不稳定膀胱形成的始动因素之一。目前研究不稳定膀胱的实验多通过手术建立膀胱出口梗阻模型进行。膀胱出口梗阻的程度无法精确控制，梗阻后受多因素影响，膀胱病理生理变化极其复杂，这使梗阻模型的研究参数很难量化，亦很难独立研究某一因素对不稳定膀胱形成的影响。连二亚硫酸钠可快速清除液体中的氧，且对液体pH值、细胞活性无明显影响[8]。本实验首先对SD幼鼠逼尿肌细胞进行体外培养，然后用连二亚硫酸钠快速清除培养基中的氧，建立体外缺氧模型，避免在体时神经、体液及张力等变化对逼尿肌细胞的复杂作用，有利于观察缺氧这一单独因素对逼尿肌细胞Cx43表达的影响。

　　缺氧条件下，生物机体内自由基代谢紊乱，机体抗氧化系统遭破坏，脂质过氧化并产生丙二醛等产物。本实验中，正常对照组逼尿肌细胞丙二醛质量浓度为(0.89±0.12)nmol/mg，缺氧处理后，A组丙二醛质量浓度为(1.40±0.14)nmol/mg，B组(1.22±0.11)nmol/mg。A、B组逼尿肌细胞的丙二醛质量浓度均较正常对照组明显增加(P<0.01)，A、B组逼尿肌细胞均因缺氧导致氧化损伤，且A组比B组损伤程度更重(P<0.05)。该结果与PAREKH等[9]研究发现的抗氧化剂VitE通过降低脂质过氧化程度及其产物丙二醛质量浓度，延缓膀胱收缩功能障碍的产生相一致。正常逼尿肌细胞以中间连接为主，而不稳定膀胱的逼尿肌细胞中间连接减少或消失，代之以丰富的缝隙连接，其通讯功能亦较正常加强。具有低电阻通路特点的缝隙连接的增多被认为是传递逼尿肌细胞异常收缩的重要条件之一[4]。本实验通过RT_PCR及Western　blot，观察到在缺氧条件下A、B两组逼尿肌细胞Cx43在转录及翻译水平均较正常对照组明显增多。经VitE预处理后，B组Cx43及Cx43mRNA表达虽较正常对照组明显增多，但却比A组少。逼尿肌细胞中Cx43及Cx43mRNA的这种变化与反映氧化损伤程度的丙二醛质量浓度变化一致。该实验结果提示缺氧可诱导逼尿肌细胞Cx43及Cx43mRNA表达增加，且与逼尿肌细胞的氧化损伤程度相关。抗氧化剂VitE可减弱缺氧诱导的Cx43高表达，这提示氧化损伤诱导的Cx43表达增加是个继发性核事件。其中涉及的机制有待进一步研究。

　　【参考文献】

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