间歇性高糖对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52EA转分化的影响

　　【摘要】 目的:探讨间歇性高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52EA转分化干预作用。方法:NRK-52E细胞分为空白组、正常葡萄糖组、高糖组、间歇性高糖组，分别作用72 h后，Western blot检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶-2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的表达;CM2H2DCFDA试剂盒检测活性氧(ROS)含量。结果:高糖组及间歇性高糖组NRK-52E细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达均上调;间歇性高糖组TGF-β1、MMP2以及α-SMA表达水平较高糖组高(P均<0.05)，其ROS含量也显著高于高糖组(P<0.01)。结论:间歇性高糖能通过氧化应激诱导肾小管导管上皮细胞表达TGF-β1、MMP2，并促进NRK-52EA细胞转分化为α-SMA细胞。

　　【关键词】 间歇性高糖;NRK-52EA 细胞;转分化

　　Effects of Fluctuating High Glucose on the Transdifferentiation of Tubule Endothelial Cell Line NRK-52EA in Mouse LIANG Hua-sheng,ZHONG Yu-huaDepartment of Endocrinology,The Ninth Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Beihai,Guangxi 536000,China)Abstract:Objective To investigate the effects of fluctuating high glucose on the transdifferentiation of tubule endothelial cell line NRK-52EA in mouse.Methods NRK-52EA cells were divided into control group,glucose group,high glucose group,fluctuating high glucose group,the expression of transforming growth factorβ1(TGF-β1),typeⅠcollagen,MMP-2,α-SMA and PTHrP were detected with Western blot,and the content of ROS was determined with CM2H2DCFDA kits after treated for 72 h.Results The expression of TGF-β1,typeⅠcollagen,MMP-2,α-SMA and PTHrP were all up-regulation in high glucose group and fluctutating high glucose group;the expression of TGF-β1,MMP-2,α-SMA and the content of ROS in fluctutating high glucose group was significantly higher than that of high glucose group(P<0.05 or P<0.01).Conclusion Fluctuating high glucose could induce the up-regulation of the expression of TGF-β1,MMP-2 in tubule endothelial cells through oxidative stress,and promote the transdifferentiation from NRK-52EAb to α-SMA.

　　Key words:Fluctuating high glucose;NRK-52EA;Transdifferentiation

　　糖尿病血糖间歇波动目前认为对于糖尿病并发症的发生、发展起着重要的作用，其危害性甚至高于持续性血糖升高。肾小管上皮细胞转分化是肾脏纤维化的重要病理基础，既往研究发现间歇性高糖能显著促进内皮细胞、心肌细胞纤维化进程[1-2]，高浓度葡萄糖也可诱导肾脏纤维化[3]，但间歇性高糖对肾小管导管上皮细胞的研究并不多见。本实验将观察不同条件葡萄糖状态下大鼠肾小管上皮细胞中调控肾小管导管上皮细胞转分化因子的表达，以探讨糖环境对肾小管上皮细胞转分化的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞培养

　　大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52EA(中科院细胞库)，DMEM培养液(美国GIBCO公司),胎牛血清(Sigma公司),双抗(青、链霉素各100 U/mL)。每周传代2~3次。PTHrP、Ⅰ型胶原(美国Santa Cruz公司)，TGF-β1、MMP-2(英国ABCam公司),α-SMA(美国Dako公司),CM2H2DCF DA(美国Invitrogen 公司)

　　1.2 细胞分组与培养

　　NRK-52EA细胞分组为：⑴空白对照组(Control)：无糖培养基未进行干预;⑵正常葡萄糖组：含5 mmoL/L葡萄糖，DMEM培养基培养;⑶高糖组：含25 mmol/L葡萄糖，DMEM培养基培养;⑷间歇性高糖组:分别应用5 mmol/L葡萄糖(培养2 h)及25 mmol/L的DMEM培养基(培养3 h)交替培养，每天重复3次，夜间5 mmol/L葡萄糖维持过夜。所有分组均在37 ℃，5% CO2条件下培养3 d。

　　1.3 Western blot 检测蛋白表达

　　常规细胞裂解获取蛋白，与预染蛋白Marker一起上样,SDS-PAGE电离,电转印到PVDF膜上，TBST封闭，4 ℃过夜。然后与一抗分别按1∶100、1∶75、1∶125、1∶75及1∶50的比例室温孵育90 min(α平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原4 ℃，过夜)，再分别与辣根过氧化物酶标记相应二抗(1∶1 000)室温孵育45 min，TBST液洗膜，ECL显色。采用Total Lab分析软件对条带进行密度扫描分析。

　　1.4 活性氧(ROS)检测

　　各组细胞加入1 mmoL/L CM2H2DCF DA(终浓度为10 μmol/L)染色液10 μL,37 ℃避光孵育30 min,离心， PBS洗2次，重悬于含10%FCS的RPMI培养液中(1 mL)。酶标仪检测OD值,激发波长485 nm，发射波长528 nm。

　　1.5 统计学分析

　　采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，One-Way ANOVA-SNK法比较总体和组间差异。

　　2 结果

　　各组细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP的表达见图1，其表达强度见图2，结果发现高糖及间歇性高糖组中TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA以及PTHrP的表达均高于空白对照组及正常葡萄糖组(各组间P<0.05);并且间歇性高糖组TGF-β1、MMP2及α-SMA表达要高于高糖组(P<0.05)。

　　图1 TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达电泳图(略)

　　不同葡萄糖条件下诱导NRK-52EA细胞株ROS含量影响,结果提示高糖及间歇性高糖均能显著促进ROS含量水平升高(4800.00±360.56，5933.33±585.95)(P<0.01)，而间歇性高糖升高ROS作用显著高于高糖组(P<0.05)。空白组(2036.67±212.21)和正常葡萄糖组(2070.00±257.62)均较前者低(P<0.01)

　　图2 TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达含量图(略)

　　3 讨论

　　近年来公布的数项世界范围大型糖尿病流行病学研究结果令人惊讶，早前英国糖尿病前瞻性研究(UKPDS)发现，单纯降低HbA1c并不能减少死亡率;而近年来ACCORD研究结果更进一步发现积极血糖治疗反而促进患者死亡率升高，该一系列研究结果与研究设想完全相斥。许多研究者认为，其主要原因可能由于积极血糖控制所导致血糖的波动致间歇性高血糖反复出现，比单纯持续性高糖更加危害机体机能。糖尿病肾病是最常见的糖尿病慢性微血管并发症，是糖尿病患者死亡的最重要因素之一，而所有糖尿病肾病病理转归即是肾脏纤维化。为此，本研究将从体外实验去揭示间歇性高糖与肾脏纤维化之间可能的联系，以进一步阐明间歇性高糖与持续性高糖间对机体危害的差异。

　　既往研究提示，高浓度葡萄糖是诱导糖尿病肾病纤维化的主要病理机制。高浓度的葡萄糖可诱导肾小管导管上皮细胞α-SMA表达[4-5]，α-SMA为肌成纤维细胞的标志性蛋白，是反映上皮细胞转分化主要观察指标。目前发现，高糖促转分化的作用机制主要是通过上调各种细胞分化或基质增殖的蛋白水平，例如TGF-β1、PTHrP、Ⅰ型胶原及MMP-2等，TGF-β1、PTHrP信号通路在器官纤维化中的作用已经明确，其水平升高可以通过上调Smad系列蛋白表达，诱导细胞转分化为纤维细胞。而Ⅰ型胶原及MMP-2是参与基质沉积及积聚的主要调控蛋白，同时以自分泌及旁分泌方式作用本体细胞或邻近细胞，从而放大纤维化效应[4-7]。其他细胞包括血管内皮细胞、平滑肌细胞等不仅是单纯性高糖，间歇性高糖同样可以从多个水平影响细胞分化通路TGFβ1/Smad信号转导，从而加重纤维化进程[2-3]。

　　本研究发现，高浓度葡萄糖环境或间歇性高糖分别作用NRK-52EA细胞后，其TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA以及PTHrP表达水平均显著上调;间歇性高糖TGF-β1、MMP2以及α-SMA表达较持续性高糖作用更为显著，该结果与Polhill等[8]对肾小球系膜细胞研究结果—间歇性高糖可以促进肾小球系膜细胞纤维化相似，故推测间歇性高糖较持续性高糖可能更容易通过激活TGF-β1、MMP-2而诱导肾小管导管上皮细胞NRK-52EA转分化为含α-SMA的间充质细胞，加重肾脏纤维化。

　　本研究结果还发现，间歇性高糖能显著上调NRK-52EA细胞株的ROS含量，其水平高于单纯性高糖组。Quagliaro等[9]研究提示间歇性高糖能通过氧化应激作用促进ROS积聚，诱导各种炎症因子包括MMP等表达，而该系列炎症因子已经被证实参与诱导肾小管导管上皮转分化为间充质细胞进程[10]，Jones等[11]也发现间歇性高糖能显著诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激反应标记物硝基酪氨酸含量升高，从而促进细胞凋亡。故认为间歇性高糖诱导NRK-52EA细胞转分化作用比持续性高糖更显著，其机制可能是间歇性高糖诱导细胞内氧化应激更严重，从而促进肾小管导管上皮细胞TGF-β1、MMP-2等系列蛋白的表达以拮抗炎症反应，而TGF-β1、MMP-2蛋白表达上调，又进一步加重肾小管上皮细胞纤维化进程。

　　综上所述，间歇性高糖对肾小管上皮细胞的损害应该更予重视。提示临床控制血糖平稳是糖尿病治疗的重要基础，在此基础上适当抗氧化治疗有望减轻氧化应激, 保护肾小管上皮细胞, 迟滞其转分化, 可能会延缓糖尿病并发症的发展。

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