天花粉蛋白诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及APC基因去甲基化

　　【摘要】 目的:研究天花粉蛋白(TCS)抗宫颈癌作用机制。方法:MTT还原法检测TCS对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用，流式细胞仪检测TCS对HeLa细胞周期及凋亡率的影响，MSP检测TCS作用前后APC基因启动子甲基化状态。结果:TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用，呈剂量依赖性;TCS可以将HeLa细胞阻滞于S期;TCS诱导HeLa细胞发生凋亡,有剂量依赖性;80 mg/L TCS处理HeLa细胞48 h后， APC基因启动子出现去甲基化。结论:TCS对HeLa细胞有明显抑制作用，抑制机理与将HeLa细胞阻滞于S期、诱导细胞凋亡及APC基因启动子出现去甲基化有关，TCS有良好的抗宫颈癌临床应用前景。

　　【关键词】 天花粉蛋白;HeLa细胞;细胞凋亡;APC基因

　　Effects of Trichosanthin on Inducing Apoptosis of Hela Cells and Methylation of APC Gene in Cervical CancerCHEN Yong,ZHENG Rong,LIU Yong-zhen,CHEN Dong-li,CHEN Shuang-yun* (Department of Traditional Chinese Medicine,Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan,Hubei 430061;Department of Gynecology,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)Abstract:Objective To investigate the mechanism of trichosanthin(TCS) against cervical carcinoma.Methods The inhibitory effect of TCS on Hela cells proliferation was detected by MTT assay.The cell cycle and apoptosis rate of Hela cells were determined by flow cytometry.The methylation status of APC gene was determined with MSP before and after treatment respectively.Results The growth of Hela cells was significantly inhibited with TCS and the inhibitory effect was dose-dependent;the differentiation of Hela cells was blocked at S-phase of the cell cycle;the apoptosis of Hela cells was induced with TCS in a dose-dependent manner;The demethylation of APC gene promoter was observed after treating with TCS at 80 mg/L for 48 h.Conclusion Trichosanthin could inhibit the proliferation of Hela cells,which may be related with the cell cycle block,apoptosis induction and demethylation of APC gene promoter.TCS may have a wide clinical respect in cervical cancer treatment.

　　Key words:Trichosanthin;HeLa cells;Apoptosis;APC gene

　　天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)为中药天花粉的有效成分, 具有多种药理学活性，已应用于临床。近年来通过对天花粉蛋白结构和功能的深入研究,发现其具有抗肿瘤的作用。 TCS可用于临床抗绒癌及葡萄胎的治疗,并对多种肿瘤细胞(如胃癌、肝癌、结直肠癌、黑素瘤和白血病细胞等)有显著的杀伤作用,是一种有前途的抗肿瘤药物和免疫毒素弹头[1]。本研究应用TCS作用于宫颈癌HeLa细胞系，观察其对细胞增殖及凋亡的影响，并研究其对HeLa细胞腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因甲基化状态的影响，探讨TCS抗宫颈癌作用及其机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 药品和试剂

　　天花粉蛋白注射液(1.2 g/L)(上海金山制药有限公司)，新生牛血清(四季青)，培养基DMEM(GBICO公司)，细胞毒性检测试剂盒及PI染料试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)，组织基因组DNA提取试剂盒及DNA Ladder(北京天根生化科技有限公司)，DNA甲基化试剂盒(北京天漠科技开发有限公司)，Taq DNA聚合酶(Promega公司)，dNTP Mix(Amresco公司)，引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

　　1.2 细胞株

　　HeLa细胞(人宫颈癌细胞)由华中科技大学附属协和医院王泽华教授惠赠。

　　1.3 细胞培养

　　培养于37 ℃，5% CO2细胞培养箱。DMEM培养基(含10%新生牛血清)培养,取对数生长期细胞待用。

　　1.4 细胞生长抑制实验

　　采用噻唑蓝(MTT)还原法:取对数生长期细胞,96孔培养板中接种细胞,每孔加含4 000个细胞的培养基200 μL,培养24 h后,吸尽培养基，以无血清培养基加TCS,使终浓度分别为10、20、40、80、160 mg/L。以有细胞不含药物的培养基为对照组，以无细胞的培养基为空白对照，每个浓度及对照均设4个复孔，分别培养24、48和72 h后,加MTT,在37 ℃培养4 h后，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO,将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，在酶标仪上检测570 nm波长处光密度值(OD值)。将各测试孔的OD值减去本底(空白对照组)OD值，各复孔的OD值取(均数±标准差)。按公式细胞抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%，计算药物对细胞生长的抑制作用。

　　1.5 细胞周期观察及凋亡检测

　　取不同浓度TCS(20、40和80 mg/L)分别作用对数生长期HeLa细胞48 h后,收集细胞，按凯基PI染料试剂盒操作说明收集处理细胞，流式细胞仪测定荧光强度,激发波长488 nm,采用Modfit分析软件进行细胞周期DNA含量分析及细胞凋亡率检测。

　　1.6 组织基因组DNA提取和DNA亚硫酸氢盐处理

　　按照组织基因组DNA提取试剂盒的说明提取HeLa细胞的基因组DNA，甲基化试剂盒的说明行DNA变性和亚硫酸氢盐转化，修饰后的DNA-20 ℃保存待用。

　　1.7 MSP(甲基化特异性PCR,methylation-specific PCR)

　　APC基因启动子甲基化检测采用MSP法，当APC基因启动子甲基化则甲基化引物有PCR产物;反之，则非甲基化引物有PCR产物。APC基因启动子区CpG岛甲基化引物：上游引物：5′-GGTATATTTTCGAGGGGTACG-3′，下游引物：5′-TTCCCGACCCGCACTCCGC-3′，产物长度90 bp;非甲基化引物：上游引物：5′-TGTGAGGGTATATTTTTGAGGGGTAT-3′，下游引物5′-CTTCTCTCTCCACTTCCCAACCCA-3′，产物长度109 bp[2]。每50 μL PCR反应体系包括：50 ng修饰后的DNA，5×PCR缓冲液10 μL，上下游引物各20 pmol， Taq DNA聚合酶1.25 u，10 mM dNTP Mix1 μL。PCR条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性60 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,循环38次,72 ℃再延伸4 min。PCR产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察并成像。

　　1.8 统计学处理

　　计量资料用x±s表示,采用SPSS 14.0统计软件。药物浓度与抑制率关系用线性回归分析，方差分析检验。细胞周期与凋亡率组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD和SNK检验(方差齐)。

　　2 结果

　　2.1 TCS对HeLa细胞生长的抑制作用

　　TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用(见表1)。同一时间下，随着TCS浓度增大，抑制率显著增大(P<0.01)。采用线性相关分析同一时间下浓度与抑制率的相关性，24 h回归方程为Y=0.187+0.002X[Y为抑制率，X为TCS浓度(单位mg/L)]，决定系数R2 =0.965，P=0.003。48 h回归方程为Y=0.331+0.002X，R2 =0.945，P=0.006。72 h回归方程Y=0.378+0.003X，R2=0.965，P=0.002。

　　表1 不同浓度TCS对HeLa细胞增殖的抑制率(略)

　　2.2 TCS对HeLa细胞周期的影响

　　分析TCS作用HeLa细胞48 h后细胞周期的变化(见表2)，HeLa细胞在20 mg/L TCS作用后G1/G0期细胞百分比与对照组比较无显著差异(P>0.05),40 mg/L、80 mg/L组与对照组比较降低(P<0.01)，三种浓度间比较有显著差异(P<0.01)。三种浓度S期细胞百分比较对照组增高(P<0.01),三种浓度间比较有显著差异(P<0.01)。三种浓度G2/M期细胞百分比较对照组均降低(20 mg/L，P<0.05;40 mg/L、80 mg/L，P<0.01)，三种浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 TCS对HeLa细胞凋亡率的影响

　　分析TCS作用HeLa细胞48 h后细胞凋亡率的变化(见表2)，三种TCS浓度作用后分别与对照组比较细胞凋亡率显著增高(P<0.01)。三种浓度之间比较亦有显著差异(P<0.01)。

　　2.4 TCS对HeLa细胞APC基因启动子甲基化状态影响

　　TCS处理前HeLa细胞APC基因启动子甲基化和非甲基化产物均为阳性,见图1。20、40 mg/L TCS处理细胞48 h，APC基因启动子甲基化状态未改变。80 mg/L TCS处理HeLa细胞48 h后，APC基因非甲基化产物有PCR扩增条带，而APC基因甲基化产物无扩增条带。

　　表2 不同浓度TCS对HeLa细胞周期及凋亡率的影响(n=3)(略)

　　注：与对照组比较,*P<0.05，△P<0.01。

　　图1 TCS处理前后HeLa细胞APC基因甲基化状态(略)

　　M1：TCS处理前甲基化产物;U1：处理前非甲基化产物;M2：80 mg/L TCS处理后甲基化产物;U2：80 mg/L TCS处理后非甲基化产物;N：水对照;PM：甲基化对照;PU：非甲基化对照

　　3 讨论

　　TCS为247个氨基酸残基组成的单一多肽链， TCS属于RNA N-糖苷酶型，专一水解核糖体28S rRNA第4324位腺苷酸的N-C糖苷键，从而引起核糖体某些区域构象的改变，影响核糖体的生物学功能，从而发挥肿瘤抑制作用[3]。TCS对HeLa细胞增殖有明显抑制作用，呈量效关系。TCS浓度与HeLa细胞增殖抑制率存在线性回归关系(P<0.01)，TCS 160 mg/L作用72 h抑制率最大，为79.79%。

　　一个细胞周期包括有丝分裂期(M)和分裂间期(G1、S、G2)，调控关键在分裂间期。TCS作用HeLa细胞48 h后，随TCS浓度增大，S期细胞百分比对照组明显增加(P<0.01)，G2/M期细胞明显减少(P<0.05)。提示HeLa细胞阻滞于S期,不能顺利地进入G2/M期。细胞的DNA不能在S期得到准确的复制，从而影响细胞增殖。细胞周期的进行由不同的周期蛋白(Cyclins)所调控。TCS作用于何种周期蛋白及其作用机制尚需进一步研究。

　　细胞增殖失控和凋亡受阻是肿瘤发生、发展的主要原因,抑制细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的重要手段之一。TCS能诱导HeLa细胞凋亡，且TCS浓度与凋亡率之间存在量效关系。有研究表明，天花粉蛋白具有核酸内切酶功能，能够切割细胞DNA超螺旋结构，导致细胞损伤[4]。另外，TCS可能通过与受体结合,引起细胞内信号途径的激活或抑制,从而启动细胞内的凋亡信号,导致细胞凋亡[5]。

　　最近研究直接分析了基因启动子的CpG岛甲基化，并与杂合性丢失或突变分析相结合, 证实启动子高甲基化是抑癌基因失活的第三种机制，并且在某些情况下是抑癌基因失活的唯一机制[6-7]。甲基化的核苷酸序列并未改变,仅通过个别碱基的修饰影响基因转录,且甲基化过程是可以逆转的。APC基因是Wnt信号传导通路中重要的抑癌基因，该基因启动子甲基化引起的基因表达缺失可导致Wnt信号传导通路的异常从而导致肿瘤的发生。APC基因启动子高甲基化及基因转录缺失已见于结、直肠癌、食道癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、T淋巴细胞瘤等肿瘤[2]。本课题组以往研究发现APC基因启动子高甲基化在宫颈癌组织标本DNA中为频发事件(95例宫颈癌标本阳性率为56.8%)，在宫颈癌各阶段均有发生，且APC甲基化阳性率随肿块增大及淋巴结转移而增高[8]。逆转APC基因启动子高甲基化状态，从而使APC基因转录激活，恢复APC基因表达，可能为宫颈治疗提供新的途径。本研究发现，TCS处理前，HeLa细胞APC基因启动子处于半甲基化状态，即MSP检测APC基因启动子甲基化产物及非甲基化产物均为阳性。20、40 mg/LTCS处理细胞48 h后甲基化状态未改变。80 mg/L TCS处理HeLa细胞48 h后，处于半甲基化状态的APC基因启动子出现了去甲基化(图1)。APC基因启动子甲基化可导致基因转录失活而致APC mRNA和APC蛋白表达缺失。当APC蛋白缺失,则不能和β-catenin结合,累积的β-catenin转位到细胞核和Tcf4结合成复合体,启动增殖相关基因(如C-MYC)转录,最终导致细胞生长失控[9]。而APC基因启动子去甲基化可恢复HeLa细胞中APC基因表达，并恢复HeLa细胞膜上β-catenin的表达[10]。TCS诱导APC基因启动子去甲基化作用可能为TCS抑制HeLa细胞增殖的作用机制之一。王艳华等[11]发现TCS 对HeLa细胞中启动子发生子甲基化失活的TSLC1(Tumor suppressor in lung cancer1) 基因也有去甲基化作用。TCS去甲基化作用为其抗宫颈癌作用提供了新的机制，也为TCS抗宫颈癌临床应用提供了新的实验依据。

　　现今最常用的甲基化抑制剂为5-氮杂-2′-脱氧胞苷等胞苷类似物,由于较强致突变性临床应用受限。TCS作为引产药已应用于临床，在抗绒癌方面研究也相当广泛，其副作用较一般化疗药明显为小。TCS具有抑制宫颈癌HeLa细胞增殖的作用，可抑制细胞周期，诱导HeLa细胞凋亡及APC基因去甲基化，有良好的临床应用前景。其早日应用于临床抗宫颈癌治疗，将为宫颈癌患者康复带来新的希望。

　　【参考文献】

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　　[11] 王艳华,黄利鸣.TSLC1基因甲基化与宫颈癌HeLa细胞凋亡相关性的研究[J].中国现代医学杂志,2007,17(21):2 775-2 578.