乳腺癌p16基因甲基化及与蛋白表达的关系

　　【摘要】 目的:探讨散发性乳腺癌中p16基因异常甲基化状况及其与蛋白表达的关系，进而研究散发性乳腺癌中p16基因异常的表遗传学作用。方法:用甲基化特异PCR(MSP)和SP法研究68例乳腺癌组织及相应癌旁正常组织中p16基因启动子甲基化状况及蛋白表达情况。结果:p16基因在68例散发性乳腺癌组织中的甲基化率为29%，且其甲基化与肿瘤组织分型、患者居住地及淋巴结转移相关(P<0.05)，而与肿瘤患者绝经与否及组织分级无关(P>0.05);P16蛋白在所有肿瘤标本中的表达下降率为51%，在相应癌旁组织中均呈阳性表达，二者有显著性差异(P<0.05)，P16蛋白表达下降与肿瘤患者淋巴结转移及患者居住地明显相关(P<0.05)，与患者绝经、组织分级和分型无关(P>0.05);在20例p16甲基化的癌组织标本中，P16蛋白表达下降率(95%)，显著高于48例未发生甲基化的乳腺癌标本下降率(33%)，两者有显著性差异(P<0.05)，乳腺癌患者组织p16基因甲基化检出率与P16蛋白表达下降率具有良好的一致性(Kappa=0.506)，而p16未发生甲基化的正常乳腺组织和乳腺良性病变组织其蛋白均呈阳性表达。结论:在散发性乳腺癌中p16启动子甲基化改变会明显降低P16蛋白表达，p16基因启动子甲基化是其蛋白表达下降的重要原因，这种机制更倾向于农村乳腺癌患者。

　　【关键词】 散发性乳腺癌;DNA甲基化;p16基因;甲基化特异PCR;表达

　　Methylation and Expression of p16 Gene in Sporadic Breast Cancer and Their RelationshipWANG Yu-pin,FENG Jing*,LV Jun,XIE Fei,GUO Yi-fei,TANG Xuan-bin,ZHANG Ji-cai Department of Clinical Laboratory;Department of Pathology,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)Abstract:Objective To investigate the methylation status of p16 gene and the level of P16 protein expression,so as to explore epigenetics role of aberrant p16 gene in sporadic breast cancer.Methods The hypermethylation status of p16 promoter regions and expression of P16 protein were determined with methylation-specific PCR(MSP) and SP staining in 68 cases of breast carcinoma tissues and homologous adjacent normal tissues.Results The methylation rate of p16 gene was 29% in 68 cases of breast carcinoma tissues and the methylation was significantly related with histological type,area,lymphatic metastasis (P<0.05) ,but had no significant relationship with menopausal status and histological stage(P>0.05).The decline rate of P16 protein expression was 51% in all carcinoma tissues,while the expression of P16 protein in adjacent normal tissues were positive and which was significant difference from that of the carcinoma tissues(P<0.05).The decrease of P16 protein expression was significantly related with lymphatic metastasis and area(P<0.05),but had no significant relationship with menopausal status,histological stage,histological type(P>0.05).The decline rate of P16 expression in 20 cases of P16 methylated tissues(95%) was significant higher than that in 48 cases of unmethylated tissues(33%)(P<0.05).There was a significant concordance between p16 methylation and its decline expression(Kappa=0.506).Conclusion The methylation change of p16 gene promoter may play an important role in the declined expression of P16 protein in sporadic breast cancer,which was inclined to rural residents.

　　Key words:Sporadic breast cancer;DNA methylation;p16 gene;Methylation-specific PCR;Expression

　　乳腺癌的发生发展是一个复杂的多因素及多阶段的过程，从基因水平研究一直是乳腺癌研究的热点。p16基因位于染色体9p21，编码细胞周期依赖蛋白激酶(CDK)的抑制因子p16INK4A，p16INK4A通过影响Rb磷酸化而调控G1期向S期转变。p16INK4A基因转录产生两种不同转录体(α或β)，编码两种不同的蛋白质，p16INK4A和p19ARF。这两种转录体具有相同的第二和第三外显子，但其第一外显子明显不同[1]。经Rb途径p16阻滞细胞周期的进展。研究发现[2]人类乳腺癌细胞系和20%~30%原发性乳腺癌的启动子5'-端和第一外显子区域发生了甲基化,甲基化表型与mRNA水平下降及蛋白质的表达水平的缺失有关。人类乳腺癌细胞中p16INK4A表达逐渐减弱与p16启动子CpG岛甲基化进程有关，其原因可能是p16INK4A表达下调不能阻止乳腺癌细胞通过M0期关卡而进入了细胞增殖周期。提示CpG岛甲基化伴随p16基因沉默可能会导致乳腺癌的形成。p16基因及其表达异常在肿瘤中更加广泛,主要原因有：p16基因的纯合性缺失、杂合性缺失;染色体易位;p16基因的CpG岛高度甲基化[3]。本研究用敏感的MSP方法检测散发性乳腺癌中p16基因甲基化状况，并对相应癌组织、癌旁组织及正常乳腺组织进行免疫组织化学测定其蛋白表达，探讨p16基因甲基化对其蛋白表达的影响，进而探讨其在散发性乳腺癌中的表遗传学作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　68例散发性乳腺癌组织及相应正常癌旁组织取自十堰市太和医院病理科术后标本。用经典的酚-氯仿提取基因组DNA。提取的DNA经紫外分光光度计定量后，-20 ℃保存备用。

　　1.2 基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰

　　参考文献[4]，取2~5 μg DNA，加双蒸水至50 μL,加入3 mol/L NaOH 5.5 μL,54 ℃放20 min变性。向己变性的DNA中加入30 μL 10 mmol/L的对苯二酚(临用时配制)和520 μL 3.6 M 亚硫酸氢钠(pH 5.0)(临用时配制)，54 ℃保温16 h。然后用Wizard DNA clean-Up System纯化，纯化后的DNA加入50 μL预温80 ℃的双蒸水溶解，并加入3 mol/L NaOH 5.5 μL,37 ℃放置15 min，加入56 μL 10 mol/L NH4Ac室温静止10 min，修饰的DNA用2.5倍体积预冷无水乙醇和1 μL糖原(10 mg/mL)沉淀DNA，-40 ℃过夜。次日再用70%酒精洗涤沉淀2次，干燥后用30 μL TE或双蒸水溶解，-40 ℃保存备用。

　　1.3 甲基化特异PCR分析

　　总体积为30 μL的反应液中含10×PCR缓冲液3 μL，Mg2+2.5 mmol/L，dNTP 250 μmol/L，每条引物[5]各0.22 μmol/L,修饰过的DNA样品4 μL,TaqDNA聚合酶(日本Takara公司)0.4 U。在PE9600上进行扩增：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，38个循环，最后1个循环70 ℃延伸5 min。将MSP产物与上样液按5∶1混合后，于2.5%琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后在紫外线下照相。人类胎盘组织DNA经甲基化酶SssⅠ转化后作为甲基化的阳性对照,健康人淋巴细胞DNA作为甲基化阴性对照。

　　1.4 免疫组织化学分析

　　采用SP法进行石蜡切片免疫组化染色，SP试剂和鼠抗人P16单克隆抗体(福州迈新公司)。用PBS代替一抗作为阴性对照，己知阳性切片作为阳性对照。结果判断：以细胞核棕黄色着色为阳性判断标准，按阳性细胞所占的比例分为：阳性细胞数<10%为显著下降(-)、阳性细胞数10%~30%为适度下降(±)、阳性细胞数>30%表达阳性(+)。

　　1.5 统计学分析

　　用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。不符合χ2检验者用Fisher精确检验,以P<0.05表示有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 p16基因启动子甲基化在散发性乳腺癌中的发生率

　　用p16基因甲基化和未甲基化引物分别对散发性乳腺癌组织及癌旁组织修饰后的DNA进行扩增。在68例散发性乳腺癌组织中，有20例(29%)检测到p16基因启动子的甲基化，所有癌旁组织均未扩增出p16启动子甲基化产物,只扩增出未甲基化产物，见图1。

　　图1 散发性乳腺癌中p16基因甲基化状况(略)

　　注：M：甲基化引物扩增条带，U：未甲基化引物扩增条带，P1-P6为乳腺癌病人组织甲基化引物扩增产物条带，Neg.：阴性对照，Pos.：阳性对照

　　经统计学分析发现,在乳腺癌组织分型、患者居住地及淋巴结转移方面，p16基因甲基化的阳性率差异有显著统计学意义(P<0.05);p16基因甲基化与肿瘤患者绝经与否及肿瘤的组织分级无明显统计学意义(P>0.05)，见表1。

　　2.2 散发性乳腺癌组织中P16蛋白的表达状况

　　68例散发性乳腺癌标本中,有35例P16蛋白表达为显著下降或适度下降(51%)，33例阳性表达，并且相应癌旁组织及正常乳腺组织p16均呈阳性表达,二者比较有显著的统计学意义(P<0.05)。P16蛋白表达下降与肿瘤淋巴结转移及患者居住地明显相关(P<0.05)，有淋巴结转移的乳腺癌蛋白表达下降率(78%)高于无淋巴结转移的表达下降率(28%)，农村居住者P16蛋白表达下降率(69%)高于城市居住者蛋白表达下降率(32%)(P<0.05); P16蛋白表达下降与否率(56%)远高于T2+T3分级的表达下降率(44%)(P<0.05);但P16蛋白的表达与绝经与否及肿瘤组织分型相比较无明显的统计学意义(P>0.05),见图2、表1。

　　表1 散发性乳腺癌中p16甲基化及蛋白表达的临床病理特征(略)

　　注:组织分型a:IDC为浸润性导管癌,ILC为浸润性小叶癌;p16表达b:p16核染色细胞数<10%为显著下降(-)、10%~30%为适度下降(±)、>30%为为表达阳性(+),“±或-”为表达显著下降或适度下降。a:病人居住城市5年以上

　　2.3 P16基因启动子甲基化与p16基因表达的关系

　　20例p16启动子发生甲基化的乳腺癌组织标本中，P16蛋白表达下降率(95%)，显著高于48例未发生甲基化的乳腺癌标本下降率(33%)二者差异有显著统计学意义(P<0.05)，乳腺癌患者组织p16基因甲基化检出率与P16蛋白表达下降率具有良好的一致性(Kappa=0.506)，见表2。而p16未发生甲基化的正常乳腺组织和乳腺良性病变组织其蛋白均呈阳性表达。提示在散发性乳腺癌中p16启动子甲基化改变会明显降低P16蛋白表达， p16基因启动子甲基化是其蛋白表达下降的重要原因。

　　表2 p16甲基化与其蛋白阴性表达的关系(略)

　　3 讨论

　　p16基因定位于人染色体9p21,表达产物为P16蛋白。研究表明,p16基因及其产物在大多数人类原发性肿瘤和细胞系中都有改变[6],60%的乳腺癌细胞系可见基因纯合缺失[7-8]。p16基因失活的主要机制是基因的纯合性缺失,点突变和DNA 原位高度甲基化也可能使基因失活,进而导致P16蛋白表达缺失,抑制肿瘤增生的能力降低。乳腺癌中p16基因发现纯合缺失和突变极低[9]，因此研究其甲基化情况为探讨其基因表达对乳腺癌发生发展的影响具有一定意义。

　　Vanzee等[10]报道原发乳腺癌和转移的乳腺癌p16基因呈低甲基化,p16基因表达增强,而正常组织p16基因高甲基化,p16基因表达缺失,故认为p16基因甲基化在乳腺癌发生中不是主要因素。Hui等[11]也发现乳腺癌晚期和淋巴结转移的患者p16基因表达加强。但Woodcock等[12]报道正常乳腺组织无p16基因甲基化,而55%的乳腺癌组织p16基因呈甲基化。亦有报道乳腺癌患者血浆p16基因甲基化与淋巴结转移,癌肿分级等有关[13]。乳腺癌患者p16基因表达异常参与了乳腺癌的进展及转移,但是p16基因甲基化与乳腺癌分级、淋巴结转移的关系未见报道。有研究用免疫组织化学法发现乳腺癌细胞p16基因蛋白缺失,总异常率为49%[14-15]。以上研究表明p16基因状态与乳腺癌的病理过程有关,p16基因失活将导致细胞周期调节环路失调,细胞过度增殖,从而成为乳腺癌发生的直接原因。检测p16基因的活性状态,能判断乳腺癌增殖、侵袭和转移的能力。

　　本研究用p16基因甲基化和未甲基化引物分别对散发性乳腺癌组织及癌旁组织修饰后的DNA进行扩增，结果提示p16基因甲基化是肿瘤特有事件，在乳腺癌组织分型、患者居住地及淋巴结转移方面，P16基因甲基化明显存在着差异，p16基因甲基化与肿瘤患者绝经与否及肿瘤的组织分级无明显区别。P16蛋白表达下降与肿瘤淋巴结转移及患者居住地明显相关，有淋巴结转移的乳腺癌蛋白表达下降率高于无淋巴结转移的表达下降率，农村居住者P16蛋白表达下降率高于城市居住者蛋白表达下降率，低分级P16蛋白表达下降率远低于高分级的表达下降率。这预示乳腺癌基因甲基化可能与环境因素、生活方式等因素有关，但需要进一步研究。且p16基因表达与乳腺癌发生发展有关，20例p16启动子发生甲基化的乳腺癌组织标本中，P16蛋白表达下降率，显著高于48例未发生甲基化的乳腺癌标本下降率，乳腺癌患者组织p16基因甲基化检出率与P16蛋白表达下降率具有良好的一致性。而p16未发生甲基化的正常乳腺组织和乳腺良性病变组织其蛋白均呈阳性表达。提示在散发性乳腺癌中p16启动子甲基化改变会明显降低P16蛋白表达， p16基因启动子甲基化是其蛋白表达下降的重要原因。

　　总之，研究p16甲基化与其蛋白表达的关系，有助于阐明散发性乳腺癌中抑癌基因失活的表遗传学机制。DNA甲基化改变具有肿瘤细胞特异性，甲基化表型早于恶性表型的出现，在肿瘤确诊之前，就可以检测到甲基化阳性的抑癌基因。发现甲基化阳性的抑癌基因用去甲基化药物进行人工靶向逆转，从而可使因甲基化失活的抑癌基因重新转录表达而早期治疗肿瘤。当然，p16基因启动子甲基化改变能否作为散发性乳腺癌独立诊断和预后判断的特异肿瘤分子标志物，尚需进一步研究证实和跟踪随访。

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