骨髓基质细胞体外三维培养的研究

　　【摘要】 目的：建立骨髓基质细胞(BMSC)体外三维培养的方法，并观察其细胞生长形态及生物学特征。方法：制备鼠尾胶原，对BMSC进行三维培养，共聚焦显微镜观察细胞形态，MTT、ALP钙钴、苏丹Ⅲ染色观察BMSC增殖及分化。结果：三维培养的BMSC早期呈现集落生长特点，后逐渐向不同的形态转变，与二维培养相比，细胞增殖峰值提前，且向成骨及脂肪细胞分化能力增强。结论：BMSC在体外三维培养模式下生长良好，能够继续保持其自我更新能力及分化潜能。

　　【关键词】 骨髓基质细胞;三维培养

　　Three-dimensional Cultivation of Bone Marrow Stromal Cells in vitroWU Yan，YANG Jian，ZHANG Hong-kao，LIU Ji-jun,LI Dong-sheng (Department of Cardiology;Department of Orthopedics，Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)Abstract:Objective To establish a method for three-dimensional cultivation of bone marrow stromal cells(BMSCs) in vitro, and to observe its growth morphology and biological characteristics.Methods BMSC were cultured with prepared collagen in a manner of three-dimensional cultivation.The morphology of BMSCs was observed under confocal microscopy,the proliferation and differentiation of BMSCs were detected with MTT,Ca-co staining and sudan-Ⅲ staining.Results BMSCs grew as colony-like at early stage,and then differentiated to different forms.Compared with two-dimensional cultivation,the peak of proliferation was in advance,and the capacity of differentiation to osteoblast and adipocyte was strengthened.Conclusion Three-dimensional cultivation of BMSCs could maintain their capacity of self-renewal and differentiation potential,and cells could grow very well.

　　Key words:Bone marrow stromal cell;Three-dimensional cultivation

　　骨髓基质细胞因其在二维培养中具有较强的自我更新能力及多分化潜能，而被认为是基因治疗中合适的种子细胞。但是细胞二维培养与体内环境有较大差别，没有了基质的支持，细胞贴壁生长，可能会失去原有的形态特征及生长分化能力。三维培养系统为细胞提供了立体的生长空间，能更好的模拟细胞在体内的生理状态。本实验在体外模拟体内环境,构建BMSCs三维培养体系，使细胞所处的环境尽可能接近体内,进一步研究BMSCs的生物学性能。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　wistar大鼠(武汉大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体质量150 g左右。实验试剂:胰蛋白酶(Gibco),谷氨酰胺(武汉天源生物技术有限公司)，胎牛血清(Gibco),DMEM干粉培养基(Hyclone)。

　　1.2 鼠尾胶原的制作实验所用胶原溶液为酸溶性鼠尾腱胶原。将wistar大鼠的尾部剪下，浸入75%的乙醇中消毒30 min，在无菌条件下将鼠尾腱抽出剪碎，置于5 g/L乙酸中，4 ℃条件下持续搅拌，48 h后低温离心去渣(10 000 r/min,30 min)，收集上清液。

　　1.3 BMSC培养按文献[1]取材。4~5周龄肝素化wistar大鼠断颈处死,无菌条件下分离双侧股骨和胫骨，在含2%胎牛血清完全培养基的玻璃平皿中，去除股骨周围组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，抽取5 mL含2%胎牛血清的完全培养基冲洗骨髓腔，离心获得骨髓细胞团，再用15%胎牛血清完全培养基将细胞团重悬为单细胞悬液，接种于玻璃培养瓶中(37 ℃，5%CO2，饱和湿度)培养，于24 h后半量换液。此后每隔2~3 d换液一次，以弃去未贴壁细胞。细胞长至70%~80%融合时传代。

　　1.4 BMSC胶原网架制作取第二代对数生长期细胞胰酶消化后，用胎牛血清制成单细胞悬液，细胞含量为2×108/L。细胞悬液∶10×DMEM∶胶原溶液按1∶12∶120的容积比例，置冰上充分混匀，用1 mol/L的氢氧化钠中和至PH值为中性。取100 μL加入一个24孔板中(板底铺多聚赖氨酸包被过的玻片)，37 ℃，5%CO2培养箱中放置10 min，待培养板中形成半固体凝胶后，加入1 mL完全培养基，于培养箱中继续孵育培养，2~3 d换液一次。培养15 d共聚焦显微镜下观察细胞生长形态特点。

　　1.5 MTT法绘制细胞生长曲线按上述方法制备BMSC胶原混悬液，将混悬液滴于24孔板中，每孔0.2 mL，置于培养箱中10 min以形成半固体凝胶。加入1 mL完全培养基于培养箱中培养，2~3 d换液1次。从培养第2天起，每次取3孔，用5 g/L胶原酶消化，制备单细胞悬液。将单细胞悬液加入180 μL新鲜DMEM完全培养基和20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h，离心后弃去培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)80 r/min振摇10 min，充分溶解，酶标仪上读取570 nm处的A值，取3孔的平均值作为增殖变化指标。连续13 d检测细胞增殖，绘制生长曲线。

　　1.6 ALP钙钴染色、苏丹Ⅲ染色培养第15天，取出细胞爬片，10%甲醛固定，0.1%Triton破膜，分别行ALP钙钴染色(入2%硝酸钴水溶液及1%硫化铵水溶液染色)、苏丹Ⅲ染色(入苏丹Ⅲ染液中孵育)，显微镜下随即选择15个不重叠视野，统计阳性染色细胞率(阳性细胞数/计数细胞总数×100%)。

　　2 结果

　　2.1 BMSC形态特征连续15 d观察发现，24 h后细胞已开始伸展呈长梭形，但在前1周内，BMSC呈现集落生长趋势，绝大部分细胞以长梭形为主，随着时间延长，近似圆形、扁形、三角形细胞逐渐增多，且细胞之间伸出突触互相连接，交织成网状结构(见图1)。

　　2.2 BMSC生长特征在15 d内，BMSC细胞数目逐渐增多，细胞体积逐渐增大，整个过程呈现出逐渐生长趋势，且第4~10天为细胞生长高峰期，到达11 d左右细胞生长基本静止(见图2)。

　　图2 三维培养中BMSC生长曲线(略)

　　2.3 BMSC向成骨细胞及脂肪细胞分化能力培养至7 d后，可见细胞形态逐渐多样化，其中以圆形或梭形多突起细胞(近似骨细胞形态)为主，该类细胞钙钴染色为阳性;细胞形态相对较大的圆形或椭圆形空泡状细胞，苏丹Ⅲ染色为阳性。钙钴染色阳性率高于苏丹Ⅲ染色细胞阳性率(见图3~4)。

　　图3 苏丹Ⅲ及钙钴染色阳性细胞率(略)

　　3 讨论

　　细胞二维培养技术已广泛应于实验研究应用,尽管逐步得到改善,但仍存在难以克服的缺点:⑴贴壁的表面积有限, 细胞产量低;⑵无菌操作过程繁琐,容易污染;⑶代谢产物逐渐堆积,排除不及时易引起细胞生长不良甚至退化;⑷细胞离开了体内同细胞外基质共同构成的三维立体结构,生物学行为受到影响,容易变异。因此,有学者提出三维培养的设想。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质(extracellularmatrix,ECM) 蛋白充当生长支架,使得三维培养模式下的细胞分化更能体现细胞在体内生长的真实过程。

　　骨髓基质细胞由于在体外可以通过贴壁培养加以分离,且具有高分裂增殖能力, 以及多向分化潜能，并易于被外源基因转染且稳定表达[2-3],被认为是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞,因此BMSC已成为该领域研究的热点之一[4-5]。

　　为探讨三维空间培养模式下，BMSC能否保持其高增殖及多向分化潜能的干细胞特性，本研究建立了三维培养模式，对BMSC在三维空间的生物学行为进行了观察。选用鼠尾胶原作为三维培养支架，原因在于胶原作为天然的生物材料，其本身无毒性，可被细胞酶类识别、标记、降解，有利于BMSC黏附、增殖和分化，极其接近人体内细胞生长环境。本研究观察结果显示BMSC在三维培养中保持了其生长增殖特性，而且其向成骨细胞及脂肪细胞的分化潜能也未丢失，该实验结果与其他学者的研究一致[6-7]。但是与本试验室既往研究[8]结果相比，三维培养的BMSC增殖速度及最终细胞总数均低于二维培养，我们分析可能由以下2个原因造成：⑴三维支架中营养物和代谢副产物的传递限制,导致了细胞生长环境中营养物浓度过低或者代谢产物浓度过高, 从而影响细胞生长;⑵细胞与周围胞外基质有相互作用,并受到调控而使细胞的生长较为缓慢。通过本实验可知三维培养的BMSC继续保持其向成骨细胞及脂肪细胞分化的能力，且向成骨细胞分化率明显高于脂肪细胞，也许间接提示BMSC作为一种成体干细胞，其在骨组织工程学方面的应用前景可能远远大于其他各个方面。

　　本实验证实，BMSC在模拟体内环境的三维培养条件下能够保持其干细胞特性，从而表明易于分离、扩增,、导入外源基因的BMSC, 有望成为细胞治疗和基因治疗的靶细胞,具有广阔的应用前景。

　　【参考文献】

　　1] Liu Y,Song J,Liu W,et al.Growth and differentiation of rat bone marrow stromal cells: does 5-azacytidine trigger their cardiomyogenic differentiation?[J].Cardiovasc Res,2003,58(2):460-468.

　　[2] Zhao LX,Zhang J,Cao F,et al.Modification of the brain-derived neurotrophic factor gene: a portal to transform mesenchymal stem cells into advantageous engineering cells for neuroregeneration and neuroprotection[J].Exp Neurol,2004,190(2):396-406.

　　[3] Wang D,Park JS,Chu JS,et al.Proteomic profiling of bone marrow mesenchymal stem cells upon transforming growth factor beta1 stimulation[J].J Biol Chem,2004,279(42):43 725-43 734.

　　[4] 李玉玲，唐俊明，潘国栋,等.DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究[J].郧阳医学院学报，2005,24(5):257-259.

　　[5] 潘国栋，王凤捷，吴 艳,等.老年骨髓基质细胞移植治疗急性心肌梗死实验研究[J].郧阳医学院学报,2004,23(2):65-67.

　　[6] Valarmathi MT,Yost MJ,Goodwin RL,et al.The influence of proepicardial cells on the osteogenic potential of marrow stromal cells in a three-dimensional tubular scaffold[J].Biomaterials,2008,29(14):2 203-2 216.

　　[7] Duggal S,Fronsdal KB,Szoke K,et al.Phenotype and gene expression of human mesenchymal stem cells in alginate scaffolds[J].Tissue Eng Part A,2009,15(7):1 763-1 773.

　　[8] 吴 艳，宋 健，万 瑜，等.外源性胰岛素样生长因子-1基因在大鼠骨髓基质细胞中的表达及对其生物学行为的影响[J].解剖学杂志,2006,29(3):265-269.