蛋白激酶D1甲基化对胃癌细胞株BGC-823增殖侵袭的影响

　　【摘要】 目的：检测蛋白激酶D1(PKD1)在胃癌细胞中的表达，并探讨其对胃癌细胞增殖侵袭的影响。方法：体外培养胃癌细胞系BGC-823，使用PKD1甲基化特异性阻断剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理胃癌细胞，Western Blot法检测胃癌细胞中PKD1蛋白的表达情况，MTT法检测胃癌细胞的增殖，Transwell实验检测胃癌细胞的侵袭力。 结果：5-Aza-CdR作用后，胃癌细胞中PKD1蛋白表达明显增加 (P<0.05)，细胞增殖速度减慢，侵袭能力减弱(P<0.05)。 结论：胃癌细胞中PKD1表达的下调在胃癌的发病过程中可能起重要作用，并可能与胃癌细胞增殖侵袭能力改变有关。

　　【关键词】 蛋白激酶D1;5-杂氮-2′-脱氧胞苷;BGC-823

　　Influence of PKD1 Methylation on the Proliferation and Invasion of Gastric Carcinoma Cells BGC-823 SUN Ke-xin,DU Tao (Department of General Surgery,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)Abstract:Objective To investigate the expression of PKD1 in the gastric carcinoma cells,and to explore its influence on the proliferation and invasion.Methods Gastric carcinoma cell lines BGC-823 was cultured in vitro and treated with DNA methylation specific inhibitor 5-Aza-CdR.The expression change of PKD1 protein and proliferation of BGC-823 cells were detected with western-blot and MTT,respectively.The invasiveness was detected with Transwell assay.Results The expression of PKD1 in BGC-823 cells was significantly increased after treating with 5-Aza-CdR(P<0.05),and the proliferation and invasiveness were significantly decreased(P<0.05). Conclusion The down-regulation of PKD1 expression may play an important role in the pathogenesis of gastric carcinoma,and it may be related with the changes of proliferation and invasion abilities in gastric carcinoma cells.

　　Key words: PKD1;5-Aza-CdR;BGC-823

　　蛋白激酶D1是新发现的PKD家族成员之一，参与了体内许多复杂的生物活动过程，包括肿瘤的发生、发展过程[1-3]。与其它肿瘤相关基因类似，许多肿瘤中存在不同程度的PKD1启动子异常甲基化。更为重要的是，PKD1无论是在激活途径及信号转导方面均不同于其他PKD亚型及经典PKC，因而作为家族中最具有特征性的成员，已成为近期研究热点。本试验使用特异性PKD1启动子甲基化抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)恢复胃癌细胞中PKD1的表达，并探讨PKD1对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其参与胃癌发病的可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂胃癌细胞系BGC-823购自武汉大学物种保存中心，RPMI-1640培养基购自Gibco公司，5-Aza-CdR购自TaKaRa公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂为sigma公司产品。Western试剂盒为美国Invitrogen 公司产品。

　　1.2 5-杂氮-2′-脱氧胞苷去甲基化BGC-823细胞为贴壁细胞，用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基在37 ℃、饱和湿度及5%CO2的细胞培养箱内传代培养。将BGC-823细胞培养在10 cm厚培养皿中，密度为1×106/d。依照文献[4]，每24 h以1 μmol/L 5-Aza-CdR处理BGC-283细胞，持续3 d后，收集细胞。Western Blot法检测5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理前后PKD1蛋白表达的情况。

　　1.3 MTT法测定细胞抑制率选择对数生长期的BGC-823细胞，用2.5 g/L胰酶消化，用完全培养液调整细胞浓度为1×105/mL，然后接种于96孔板(每孔100 μL)培养。24 h后弃培养液换含不同浓度(2、4、8 μmol/L) 5-Aza-CdR的培养液20 μL，于37 ℃继续培养。分别于24、48、72 h后弃上清, 每孔加新配制的5 mg/mL MTT液20 μL，37 ℃继续培养。4 h后终止培养, 轻轻吸弃孔中上清, 每孔加入DMSO 150 μL溶解甲簪沉淀,用微型超声震荡器震荡摇匀10 min, 使紫色结晶充分溶解,在酶标仪上测定490 nm下的吸光值(A值),以空白孔调零。同时设阴性对照组(加入20 μL完全培养基)和空白对照孔(只加入20 μL完全培养基，不含细胞)，每组浓度设3个平行孔，结果取其平均值。细胞增殖抑制率=(对照组A值-试验组A值)/对照组A值×100%。

　　1.4 Western Blot测定PKD1蛋白表达取对数生长期肿瘤细胞裂解液提取总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。每种样品以40 μg总蛋白上样，进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，200 V，40 min。电泳结束后，取下凝胶，25 V电转2 h,使蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC)上。将NC膜用封闭液常温封闭非特异性抗原2 h。加入一抗(兔抗人PKD1抗体，1∶200稀释)，4 ℃摇床孵育过夜。TBS清洗后加入HRP标记的二抗(羊抗兔IgG,1∶2 000稀释)室温孵育1 h。将NC膜置于ECL(增强化学发光试剂)中反应1～3 min，暗室中使X线片曝光，常规方法显影定影。X线片上的条带用图像分析系统进行分析,测定积分灰度值，将PKD1/α-tubulin的比值作为蛋白表达的相对量。

　　1.5 Transwell实验

　　分为实验组和对照组，分别为经过5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理的BGC-823细胞及普通BGC-823细胞，培养72 h后将含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至4×104 /mL，选用孔径8 μm、总直径6.5 mm的聚碳酸酯膜，将基质胶和25 μg/mL纤维连接蛋白包被膜的上室面，37 ℃ 1 h。将含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度至4×104/mL，在上室中加入100 μL细胞悬液，24孔培养板覆盖，孵育5 h，让细胞充分接触。在下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，并加入30 μg/mL表皮生长因子置于基质表面作为趋化因子，37 ℃孵育5 d。取出各组Transwell小室,PBS冲洗2次以去除未穿膜细胞，95%酒精固定30 min，聚碳酸脂膜固定于载玻片上染色。250倍光镜下随机取5个视野，计数穿透到滤膜背面的细胞数，以穿膜细胞的相对数目表示侵袭力的大小。

　　1.6 统计学分析应用SPSS 11.5软件包进行分析，组间比较采用t检验。P<0.05认为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Western blot 法检测5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理前后胃癌组织中PKD1蛋白的表达

　　5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理前的光密度为(0.354±0.035)，处理后为(0.661±0.028),差异有统计学意义(P<0.05) (图1)。

　　图1 5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理前后胃癌组织中PKD蛋白的表达(略)

　　1为5-Aza-CdR处理前;2为处理后

　　2.2 MTT法检测BGC-823细胞的增殖

　　由表1可知,与对照组细胞相比，72 h后8 μmmol/L 5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理组细胞增殖抑制率增高，细胞生长减慢(P<0.05)，但无明显的量效和时效关系。

　　表1 不同浓度5-Aza-CdR对BGC-823细胞增殖的抑制作用(略)

　　注：*P<0.05

　　2.3 Tanswell实验

　　处理组每200 倍视野计数BGC-823细胞的穿透数为(43±5)个,而未处理组的穿透数为(81±4)个,两组相比差别具有显著性意义(P<0.01),见图2。

　　3 讨论

　　肿瘤学研究表明，DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖、分化、发育及基因组印迹等方面起重要作用，并与肿瘤的发生、发展关系密切。甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR为一种嘧啶类似物，该制剂可与DNA甲基转移酶I形成共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，从而导致形成低甲基化的子链，实现去甲基化功能[5]。

　　蛋白激酶家族存在于大多数真核细胞内，参与细胞内多种信息传递过程。PKD作为一类特殊蛋白激酶家族，已从蛋白激酶C家族中独立出来，在人类有PKD1、PKD2、PKD3三种亚型[6]。PKD1是其家族中最具有特征性的成员之一，又称PKCμ,它不需要钙和二酰基甘油(DG)激活,而由磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸激活。PKD1在许多复杂的细胞活动如氧化应激，跨膜转运，信号转导，细胞黏附、迁移、存活、增生、分化及凋亡中均起重要作用[1-3]。体内PKD1的活化主要依赖于PLC-DAG-PKC-PKD途径，目前对其下游调节信号研究得比较透彻的是E-钙黏附素、β-连环蛋白和NF-κB。Meena等小组进行了一系列研究，发现在前列腺癌细胞中PKD1能与E-钙黏附素-连环蛋白复合物相互作用，PKD1通过磷酸化B连环蛋白的Thr112和Thr120与其发生作用，磷酸化E-钙黏附素，从而增加细胞聚合，降低细胞活性[7-9]。PKD1是PKCδ和PKCε诱导NF-κB活化所必须的，还是PKCδ和PKCε信号通路介导的NF-κB活化的早期信号汇集点之一[10]。此外，Jeoung等发现在巨噬细胞中，PKD1参与TLR9信号通路以及NF-κB和促分裂原活化蛋白激酶的表达，认为PKD1是TLR9介导的巨噬细胞活化的调节信号之一[11]。除了接受上游信号调节，PKD1还能通过不同的机制，能自身磷酸化Ser744/Ser748 和 Ser916，从而影响改变其在细胞内的表达[12]。

　　大量研究表明，DNA异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中起重要作用。Mirang 等用限制性标记基因扫描技术RLGS发现,胃癌细胞中存在PKD1启动子的异常甲基化，由此推测其在肿瘤的发生发展中起重要作用[4]。本实验使用甲基化特异性阻断剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理胃癌BGC-823细胞系，发现处理后胃癌细胞中PKD1蛋白的表达含量明显升高(P<0.05)。这表明，胃癌细胞中存在着PKD1启动子的异常甲基化，从而导致了PKD1基因的表达下降，更重要的是这种甲基化在胃癌的发生中是一种早期事件。推测PKD1在胃癌的发生中起重要的作用。

　　随后研究5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理后胃癌BGC-823细胞的增殖抑制和侵袭能力，结果发现8 μmol/L浓度5-Aza-CdR作用72 h后，胃癌细胞增殖抑制率明显增加。通过transwell小室试验发现，处理前胃癌BGC-823细胞的穿膜细胞数为(81±4)，处理后的穿胞数为(43±5)，差异具有统计学意义(P<0.05)。这表明，随着PKD1启动子甲基化的抑制，PKD1表达的恢复，从而导致细胞增殖和侵袭力下降。由此推测，PKD1与胃癌细胞增殖和侵袭能力有关，其后天的表达下降可能增加了胃癌细胞的增殖和侵袭能力。可能的机制是，通过上游信号如射线、突变等信号刺激，PKD1启动子异常甲基化，从而导致细胞中PKD1表达下调，细胞侵袭能力增强。

　　综上所述，PKD1基因在胃癌的发生、进展中起重要作用，PKD1启动子超甲基化导致表达的缺失，可能是胃癌发生的一个早期事件。胃癌中PKD1基因的后天缺失增加了肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，因而进一步研究PKD1缺失诱导的肿瘤细胞侵袭的信号机制显得非常重要。最后，作为DAG和PKC信号传导网络的交叉点，PKD1可能是一种有用的评价发展期胃癌危险性的分子生物标记，并且可能成为治疗靶点，以PKD1为靶点的选择性抑制剂和激活剂的筛选将成为今后研究的热点。

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