热休克蛋白701基因多态性与冠心病的关联性研究

　　【摘要】 　　目的：探讨热休克蛋白701(HSP701)基因多态性与冠心病的关系。方法：采用病例-对照1:1研究设计。选择湖北省三家综合性医院的217例冠心病患者作为病例组，同时选年龄、性别匹配的217例健康者作为对照组。采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCRRFLP)方法检测HSP701多态性。结果：HSP701基因各基因型及等位基因频率在两组中的分布差异有统计学意义。结论：HSP701基因多态性可能是冠心病的易感基因。

　　【关键词】 热休克蛋白70 基因多态性 冠心病

　　Association Study of Heat Shock Protein 701 Gene Polymorphism and Coronary Heart Disease LIU Yong1,2,YANG Handong2*,MIN Xinwen2,LI Dongfeng2 (1Department of Cardiovascular Disease,Renmin Hospital,Wuhan University,Wuhan Hubei 430061;2Department of Cardiovascular Disease,Dongfeng Hospital,Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000, China)

　　Abstract：Objective To explore the association between gene polymorphism of heat shock protein 701(HSP701) and the susceptibility to coronary heart disease. Methods A matched casecontrol study was performed.Two hundreds and seventeen patients with coronary heart disease were selected as case group from three general hospitals in Hubei province,and 217 healthy subjects with age and gender matched were simultaneously selected from the same geographic area as control. HSP701 genotypes were determined with polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism(PCRRFLP).Results There were significant diferences in the distribution of HSP701 genotypes and allele frequency between case group and control group.Conclusion HSP701 gene polymorphism may be one of genetic susceptibility factors of coronary heart disease.

　　Key words：Heat shock protein 70;Gene polymorphism;Coronary heart disease

　　冠心病(coronary heart disease，CHD)是一种常见于40岁以上中老年人的多病因疾病，也是危害职业人群健康最常见的疾病之一。随着冠心病发病率及死亡率的上升，对其病因学方面的研究已成为目前研究的重点和热点，但其发病机制尚不清楚。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)又称为应激蛋白，是生物细胞在受热、生物应激、理化因素应激原刺激后，所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。在许多情况下HSP70在心血管系统优先表达，尤其是在血量丰富的组织，如脑、肝脏、肺脏、心脏等，这说明HSP70与心血管系统有密切的联系。为研究冠心病患者与HSP701基因多态性的相关性本课题进行了初步探索。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　病例组选自2005年8月-2007年12月期间就诊于武汉同济医院，武汉协和医院和武钢总医院的冠心病患者。CHD诊断依据WHO诊断标准或经冠脉造影显示有一支或一支以上冠脉狭窄≥50%者。对照组来自2007年夏季武钢总医院体检人群。正常对照组均经过严格病史询问、体格检查、心电图检查和一般生化指标检查，检查结果无CHD、严重的肝、肾疾病者入选，有周围血管疾病或周围血管栓塞疾病者均未入选。

　　1.2 DNA 的提取

　　基因组DNA抽提使用PUREGENE DNA提取试剂盒(德国 Gentra公司)从全血中提取DNA，并于-80 ℃冰箱长期保存。

　　1.3 基因型的测定

　　扩增HSP701基因的上游引物为5′CTTCCCAGAGCGAACCTGTG3′，下游引物为5'GCAGAACACCGTGTTTGACG3′，用25 μL PCR反应体系，反应条件为94 ℃预变性5 min后、按94 ℃变性30 s、61 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，进行30个循环，末次循环后72 ℃延伸10 min;20 μL酶切体系包括10 μL PCR 产物和5U限制性内切酶BsrB I，37 ℃酶切4 h。酶切及琼脂糖凝胶电泳后可见在 351 bp的HSP701 PCR产物中，GG基因型携带者为171、116、64 bp共3个片段，GC基因型为287、171、116、64 bp共4个片段，CC基因型为287、64 bp的2个片段。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件处理，等位基因频率采用频率计数法计算。组间基因型和等位基因频率及计数资料比较用χ2检验。以α=0.05为差异显著性水平。

　　2 结果

　　2.1 研究对象一般人口学特征

　　纳入本次研究的均为中国汉族人，冠心病组217例，其中男性133例，女性84 例，平均年龄(61.24±9.34)岁。对照组217例，其中男性133例，女性84例，平均年龄(62.08±8.17)岁。两组性别、年龄构成差异均无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 遗传平衡检验

　　将对照组的HSP701基因各基因型代入HardyWeinberg遗传平衡定律，进行群体代表性检验。结果HSP701各基因型频率与期望值基本吻合(χ2=0.318，P>0.05)，基本符合HardyWeinberg遗传平衡定律。

　　2.3 HSP701各基因型在病例组和对照组的分布

　　HSP701基因190位点各基因型及等位基因基因频率在两组人群的分布差异有显著性(P<0.05)，见表1。表1 HSP701基因各基因型在病例组

　　3 讨论

　　热休克蛋白是生物细胞受到高温、感染、炎症、缺血等应激刺激时产生的一种在进化上高度保守的蛋白质，具有广泛的生物学功能。HSP70是HSP家族中最保守和最主要的一类，HSP70具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能，参与免疫反应，抗细胞凋亡功能，抗氧化功能，提高细胞的应激耐受性，促进细胞增殖，参与细胞骨架的形成和修复等，广泛的生物学功能使其成为当今生命科学研究中的热点[1]。

　　HSP701基因定位于6p21.3区MHCⅢ类分子内[2]，呈低水平表达。HSP701基因在110、120、190等位点存在多态性。HSP701基因190位点位于该基因5'侧翼区，该位点的G→C多态可能影响mRNA的转录，从而对诱导HSP70表达水平产生影响。目前已有研究证明HSP70与冠心病存在相关性。Benjamin等[3]发现大鼠动脉粥样硬化的血管HSP70表达显著增加;Bobryshev等[1]发现，HSP70在人和兔动脉硬化斑块中的血管平滑肌细胞及巨噬细胞中的表达增多，并与细胞坏死相关;Lee等[4]的体内和体外试验研究也表明HSP70表达增多与脑缺血相关。研究还发现，长期处于人际关系紧张、工作负荷超强和家庭环境不稳定等应激状态下HSP70生成增多，心脑血管疾病的发生概率明显升高[5]。但目前有关HSP701基因多态性与疾病的关系研究较多的是自身免疫性疾病和炎性疾病[6]。Ridker等[7]研究发现体内持续的低水平的炎性反应是导致动脉粥样斑块和血栓形成的主要因素，而后两者是冠心病的主要危险因素。

　　对于HSP701基因190位点多态性与疾病的研究较少。Wu等[8]发现其与帕金森病相关，CC基因型在病例组分布较对照组高;Fraile等[9]在强直性脊柱炎等免疫性疾病中也发现CC基因型在病例组分布较对照组高。而关于HSP701基因190位点与冠心病关系方面的研究尚无报道。

　　本研究对湖北地区217例冠心病患者和217例健康者中HSP701基因190位点的基因多态性进行了对比研究，结果发现冠心病患者和健康对照者的基因频率分布和等位基因频率差异有统计学意义(χ2=11.715，P<0.05和χ2=5.575，P<0.05)。其中冠心病患者CC基因型频率明显高于健康对照者。提示C等位基因可能造成mRNA转录水平降低，致使HSP70合成减少，从而导致个体损伤。

　　总之本文对HSP701基因多态性与冠心病的关系进行了初步探索，且为武汉地区人群HSP701基因190位点多态性的分布和频率提供了基础信息。本次研究认为HSP701基因190位点多态性可能与冠心病易感性相关。

　　【参考文献】

　　[1]Bobryshev YV,Lord RS.Expression of heat shock protein70 by dendritic cells in the arterial intima and its potential significance in atherogenesis[J].J Vasc Surg,2002,35(2):368-375.

　　[2]Milner CM,Campbell RD.Genetic organization of the human MHC class III region[J].Front Biosci,2001,6:914-926.

　　[3]Benjamin IJ,McMillan DR.Stress (heat shock) proteins:molecular chaperones in cardiovascular biology and disease[J].Circ Res,1998,83(2):117-132.

　　[4]Lee JE,Yenari MA,Sun GH,et al.Differential neuroprotection from human heat shock protein 70 overexpression in in vitro and in vivo models of isehemia and ischemialike conditions[J].Exp Neurol,2001,170(1):129-139.

　　[5]Ko SM,Kua EH,Ng TP,et al.Life events and minor psychiatric morbidity in a community survey[J].Stress Health,2001,17:41-46.

　　[6]Porto I,Leone AM,Crea F,et al.Inflammation,genetics,and ischemic heart disease: focus on the major histocompatibility complex (MHC) genes[J].Cytokine,2005,29(5):187-196.

　　[7]Ridker PM,Hennekens CH,Buring JE,et al.Creactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women[J].N Engl J Med,2000,342(12):836-843.

　　[8]Wu YR,Wang CK,Chen CM,et al.Analysis of heatshock protein 70 gene polymorphisms and the risk of Parkinson's disease[J].Hum Genet,2004,114(3):236-241.

　　[9]Fraile A,Nieto A,Matarán L,et al.HSP70 gene polymorphisms in ankylosing spondylitis[J].Tissue Antigens,1998,51(4):382-385.