醛固酮对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子的影响

　　【摘要】 　　目的:探讨醛固酮(ALD)对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响，及转化生长因子β1(TGFβ1)是否参与其信号通路。方法:大鼠肾小球系膜细胞加入不同浓度的ALD共同培养0、12、24、36、48 h，RTPCR方法评价CTGF mRNA的表达;用ELISA方法检测TGFβ1蛋白的表达;并用TGFβ1/Smads信号通路的特异性丝、苏氨酸激酶抑制剂Staurosporine(STA)加以对比。结果:ALD刺激后肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达水平增加，且呈剂量依赖性，TGFβ1蛋白表达也明显增加;用STA预处理1 h后再用ALD刺激24 h, 则CTGF mRNA的表达无明显变化。结论:ALD通过TGFβ1/Smads途径上调肾小球系膜细胞表达CTGF。

　　【关键词】 醛固酮 结缔组织生长因子 转化生长因子β1 肾小球系膜细胞 信号途径

　　Effect of Aldosterone on the Expression of Connective Tissue Growth Factor in Cultured Rat Mesangial Cells BAI Shoujun1,2,ZHANG Yong2,ZHANG Jiane2,LI Caixia1,XU Gang1*,LIU Xiaocheng1 (Department of Nephrology,1Tongji Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030;2Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 44200,China)

　　Abstract:Objective To explore the effect of aldosterone on the expression of CTGF in cultured rat mesangial cells,and whether TGFβ1 was involved in the signaling pathway.Methods Rat glomerular mesangial cells were incubated with aldosterone at different concentrations for 0,12,24,36,48 h,respectively. The expression of CTGF mRNA was determined with RTPCR,and the expression of TGFβ1 protein was assessed with ELISA.Staurosporine,a Serine/Threonine kinase inhibitor of TGFβ1/Smads signaling pathway,was used to inhibit CTGF expression.Results The level of CTGF mRNA was significantly increased after exposure to aldosterone,and it was dosedependent,the expression of TGFβ1 protein was also significantly increased.However,aldosterone could not stimulate the expression of CTGF mRNA with staurosporine pretreament for 1 h.Conclusion Aldosterone could upregulate the expression of CTGF in cultured rat mesangial cells through TGFβ1/Smads signaling pahtway.

　　Key words:Aldosterone;Connective tissue growth factor;Transforming growth factorβ1;Glomerular mesangial cell;Signaling pathway

　　肾小球硬化和肾小管间质纤维化是各种原因引起的肾脏疾病进展至终末期肾衰的共同病理特征,致纤维化细胞的增生,细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成的增加与降解的减少,导致ECM的大量沉积是其直接原因[1]。转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是公认的两个重要的致肾纤维化因子，CTGF是TGFβ1下游因子，TGFβ1主要是通过CTGF引起ECM的增多而发挥致纤维化作用。近年来研究发现, 醛固酮(Aldosterone，ALD)亦是重要的致纤维化因子之一，可以引起ECM的沉积，促进肾脏纤维化[2]。然而，ALD导致肾纤维化的分子机制仍不清楚，本研究旨在讨论体外ALD能否刺激CTGF的表达，以及其信号通路是否经TGFβ1途径介导。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要实验材料和仪器

　　SD大鼠肾小球系膜细胞株(武汉大学生科院动物保藏中心)，胎牛血清(杭州四季青)，DMEM/F12(1∶1)培养液(美国GIBCO)，醛固酮、Staurosporine(美国Sigma)，Trizol(美国Invitrogen)，两步法RTPCR试剂盒、Taq PCR Mix(美国Promega)，大鼠TGFβ1试剂盒(美国RB公司)，PCR仪(德国Biometra)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养和分组:SD大鼠肾小球系膜细胞株，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养液，含青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/L，在37 ℃、5%CO2培养箱内培养，取第4代细胞用于实验。当传代细胞长至70%～80%融合时换无血清培养液继续培养24 h，以同步化处理。试验分组如下：⑴空白对照组;⑵ALD刺激组：分别用ALD(10-5～10-9 mol/L)刺激;⑶干预组：STA(5 nmol/mL)预处理1 h后加ALD(10-7 mol/L)刺激24 h。

　　1.2.2 RTPCR检测CTGF mRNA的表达:按以上分组Trizol提取总RNA，按两步法RTPCR试剂盒检测CTGF mRNA的表达，CTGF引物上游5′GTAAAGCCAGGGAGTAAGGA3′，下游5′CACAAGCTGTCCAGTCTAAT3′,[476 bp];βactin为内参照，上游5′TCGTACCACTGGCATTGTGA3′，下游5′TCCTGCTTGCTGATCCACAT3′，[266 bp]。CTGF mRNA 的cDNA扩增条件为：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 45 s，退火56 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s,共30个循环，结束循环后再延伸72 ℃ 7 min，4 ℃终止。取6 μL PCR扩增产物于质量浓度为1 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，采用kodak science凝胶图像分析系统扫描、分析电泳条带，以CTGF与βactin的电泳条带的光密度比值来作为CTGF mRNA的相对表达量，每组重复4次。

　　1.2.3 ELISA方法检测TGFβ1蛋白表达水平:按ELISA试剂盒说明，用酶标仪做出标准曲线，计算大鼠肾小球系膜细胞上清液中TGFβ1蛋白的浓度，每组重复4次。

　　1.3 统计学方法

　　计数资料用均数±标准差(x±s)表示，两组比较采用t检验,多组之间差异的显著性采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义,由SPSS 10.0统计软件完成。

　　2 结果

　　2.1 ALD对肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达水平的影响

　　ALD(10-9 mol/L)可刺激肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达水平增加，与对照组比有统计学意义(P<0.05)，随着ALD(10-8mol～10-5mol)浓度的增加，表达逐渐加强，与对照组比，P<0.01。CTGF与βactin的电泳条带的光密度比值依次为：0.23±0.03、0.34±0.06、0.46±0.09、0.54±0.08、0.69±0.10。ALD(10-7 mol/L)刺激12 h后CTGF mRNA表达已渐增加，密度扫描均值0.28±0.04，为空白对照组的1.41倍;24 h达高峰，密度扫描均值0.46±0.08，为空白对照组的2.32倍;36 h较12 h稍下降，密度扫描均值0.32±0.06，48 h明显下降，各组间相比有统计学意义，P<0.05。ALD刺激肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达水平呈剂量依赖性和时间依赖性，分别见图1～2。

　　2.2 ALD对肾小球系膜细胞表达TGFβ1蛋白的影响

　　应用ELISA方法，对照组培养的肾小球系膜细胞上清液中TGFβ1蛋白表达水平为(180.47±10.57) pg/mL，ALD(10-7mol/L)刺激24 h后，TGFβ1蛋白表达水平明显增高，为(297.53±15.25) pg/mL，与对照组比，有统计学意义(P<0.05)。 应用STA(5 ng/mL)预处理1 h后，再用ALD(10-7mol/L)刺激24 h，发现培养的肾小球系膜细胞上清液中TGFβ1蛋白表达水平没有明显下降，为(269.83±12.19) pg/mL，与刺激组比无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 STA对ALD刺激肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达的影响

　　ALD刺激大鼠肾小球系膜细胞24 h后，CTGF mRNA表达明显增高，密度扫描均值为0.47±0.04，与对照组(0.23±0.04)比有统计学意义(P<0.01)。用STA(5 ng/mL)预处理1 h后再用ALD(10-7mol/L)刺激肾小球系膜细胞24 h后，CTGF mRNA的表达无明显变化,其结果为0.24±0.06，与对照组比,无统计学意义(P>0.05),见图3。

　　图3 STA对ALD刺激肾小球系膜细胞

　　CTGF mRNA表达的影响

　　3 讨论

　　肾素血管紧张素醛固酮系统(RASS)在肾小球硬化和肾间质纤维化中起重要作用。醛固酮生理作用主要是调节水电解质和血容量的平衡。病理情况下可由AgⅡ介导及引起血压升高致靶器官损害。近年来发现在血管系统、心脏、肾脏中，醛固酮还经过非血流动力学和直接作用，多数通过盐皮质激素受体诱导氧化应激、血栓形成、压力感受器损害、内皮细胞功能异常、血管顺应性下降、炎症反应和纤维化致组织和器官损伤[3]。特别在致组织器官纤维化方面，ALD是有丝分裂和胶原合成的强烈刺激剂，可以促进肾脏纤维化[4]。

　　众多的研究已探讨ALD导致靶器官纤维化的分子机制。已证明，ALD可上调血管紧张素Ⅱ受体表达，增强血管紧张素Ⅱ压力感受器的作用;抑制血管平滑肌细胞和心肌细胞对去甲肾上腺素摄取，参与血管平滑肌细胞肥大调节;调节血管紧张素Ⅱ对PAI1的表达增加[5];刺激骨调素(osteopontin)合成;激活明胶酶(gelatinase)的合成;激活转化生长因子β1合成[6];产生活性氧[7]，促进血管平滑肌细胞钠内流，引起内皮细胞功能障碍。国内的研究发现，大鼠肾小球系膜细胞能够合成和分泌醛固酮，并促进肾小球系膜细胞ECM的合成[8]。

　　TGFβ1是促进肾脏纤维化发展最重要的细胞因子之一，它既可以促进ECM的合成,又能抑制其降解。一方面，TGFβ1能刺激肾近曲小管上皮细胞转分化及系膜细胞产生并分泌Ⅰ、Ⅳ型胶原。另一方面，TGFβ1通过阻止基质金属蛋白酶(MMPs)的合成和刺激基质金属蛋白酶阻滞剂(TIMPs)的产生来抑制ECM 降解。以上原因均可引起ECM的增多，在肾脏中沉积，导致肾脏纤维化。CTGF是TGFβ1的下游因子，生物学作用比较单一，正常情况下体内表达无或较少，病理情况下明显增多，其能刺激纤维连接蛋白，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 型胶原，层粘连蛋白，整合素等ECM 成分合成，用抗CTGF中和抗体或CTGF反义核酸可以阻滞CTGF这一作用，也能抑制某些药物或TGFβ1所诱导的ECM成分产生。多种因子介导CTGF的致纤维化作用，其中TGFβ1是最强、最重要的因子。

　　最近国外学者发现，醛固酮可以诱导胚胎心肌细胞结缔组织生长因子的表达，引起心肌纤维化[9]。但醛固酮能否促进肾小球系膜细胞表达CTGF仍不清楚。本研究发现，在基础情况下，系膜细胞只有少量的CTGF表达，加入ALD(10-7 mol/L)刺激12 h后，CTGF mRNA表达开始增加，24 h达高峰，36 h较24 h稍下降，48 h表达明显降低。 ALD刺激的CTGF mRNA表达呈时间、剂量依赖性反应。本研究结果表明ALD可刺激肾小球系膜细胞CTGF 表达水平增加，ALD可能通过促进CTGF的表达而发挥致纤维化效应。

　　醛固酮通过何种信号途径来调节CTGF的表达，国内外较少报道。国外学者在胚胎心肌细胞的研究中发现，醛固酮可通过其细胞膜盐皮质激素受体和P38 MAPK途径来调节CTGF的表达[9];Riser等研究发现，醛固酮可通过蛋白激酶C(PKC)直接促进CTGF的表达[10]。近年来的研究证实TGFβ1主要通过Smads途径诱导CTGF的表达，CTGF基因启动子上具有一Smads反应元件，TGFβ1与Smads结合的受体为特异性丝/苏氨酸受体。本实验用其特异性受体抑制剂STA(5 ng/mL) 预处理大鼠肾小球系膜细胞1 h后，用醛固酮(10-7mol/L)刺激，发现CTGF的表达显著受到抑制，而TGFβ1表达没有受到抑制，说明醛固酮可能通过TGFβ1途径来调节CTGF的表达,TGFβ1/Smads信号途径可能参与醛固酮对CTGF的调节。

　　综上所述，醛固酮是一个重要的致肾小球硬化的因素，可能与体内TGFβ、CTGF两大致纤维化因子交互作用，共同影响肾脏疾病的发生、发展，明确其致肾小球硬化的机制，将为肾脏疾病的防治提供新的思路。

　　【参考文献】

　　[1]el Nahas AM.Pathways to renal fibrosis[J].Exp Nephrol,1995,3(2):71-75.

　　[2]Brown NJ.Aldosterone and endorgan damage[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2005,14(3):235-241.

　　[3]Struthers AD, MacDonald TM.Review of aldosterone and angiotensin Ⅱinduced target organ damage and prevention[J]. Cardiovasc Res,2004,61(4)：663-670.

　　[4]Hostetter TH, Rosenberg ME, Ibrahim HN,et al.Aldosterone in renal disease[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2001,10(1):105-110.

　　[5]Brown NJ, Nakamura S, Ma L,et al.Aldosterone modulates plasminogen activator inhibitor1 and glomerulosclerosis in vivo[J].Kidney Int,2000,58(3):1 219-1 227.

　　[6]Han JS, Choi BS, Yang CW,et al.Aldosteroneinduced TGFbeta1 expression is regulated by mitogenactivated protein kinases and activator protein1 in mesangial cells[J]. J Korean Med Sci,2001,24(1):S195-203.

　　[7]Rotstein OD.Oxidants and antioxidant therapy[J].Crit Care Clin,2001,17(1):239-247.

　　[8]赖凌云，顾 勇，陈 靖，等.大鼠系膜细胞醛固酮的合成及其对细胞外基质生成的影响[J].中华医学杂志,2003,83(21)：1 990-1 905.

　　[9]Lee YS, Kim JA, Kim KL,et al.Aldosterone upregulates connective tissue growth factor gene expression via p38 MAPK pathway and mineralocorticoid receptor in ventricular myocytes[J].J Korean Med Sci,2004,19(6):805-811.

　　[10]Riser BL, Denichilo M, Cortes P,et al.Regulation of connective tissue growth factor activity in cultured rat mesangial cells and its expression in experimental diabetic glomerulosclerosis[J].J Am Soc Nephrol,200,11(1):25-35.